近日，华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室、农学院和生命科学学院刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在生物工程领域国际著名期刊Biotechnology Advances在线发表了题为The type V effectors for CRISPR/Cas-mediated genome engineering in plants的综述论文，系统介绍了V型效应蛋白(CRISPR/Cas12)的特点以及目前发现新效应蛋白的方法，总结了近年来工程化的Cas12家族效应器的改进与发展，及其在植物基因编辑中的应用，包括碱基编辑器、基因表达调节工具、基因敲入和生物传感器等的应用，为Cas12蛋白家族成员在作物遗传改良和提高农业生产等方面的应用，提供了研究思路与有益的参考。
根据Cas效应蛋白的组成将CRISPR/Cas系统分Class Ⅰ和Class Ⅱ两大类，根据其作用方式进一步划分为六种类型 (Type Ⅰ~ Ⅵ)。在两类系统中，Class Ⅰ (Type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ)需要多个蛋白亚基组成复合体共同作用才能够发挥功能，而Class Ⅱ (Type Ⅱ, Ⅴ, Ⅵ) 则只需在单一Cas蛋白与相应向导RNA (guide RNA)介导下发挥针对核酸链的干扰功能（图1）。尽管目前已挖掘并检测到多个CRISPR Cas系统的体外DNA切割和操纵的能力，但目前在真核细胞中能够高效作用系统仍旧只有SpCas9和AsCas12a，分别属于Class Ⅱ -Type Ⅱ和Class Ⅱ-Type Ⅴ。
图1. 各类CRISPR系统的特点及type V CRISPR系统的系统发育树。A. CRISPR Class I和Class II基因座中元件的一般分布图。B. CRISPR系统中不同类型蛋白质所需的组分及其特性。C. CRISPR Class II type V家族的系统发育树，包括RuvC活性结构域的氨基酸 (Asp-Glu-Asp, DED) 。
对比Cas9，Cas12拥有多个不同的特征。例如，Cas12a（Cpf1）蛋白不仅可以切割目标DNA，还能加工crRNA，且不需要tracrRNA，这使得Cas12a的crRNA更短，更有利于多重基因编辑 ；单独的RuvC样结构域使得切割DNA产生的双链断裂不对称，从而形成粘性末端，有利于产生基于HDR的修复，从而提高植物精准基因编辑；此外，一些Cas12家族蛋白如Cas12c （Type V-C）和Cas12m （Type V-M）具有天然非典型的RuvC结构域，无核酸酶活性，使得其天然发挥CRISPRi的能力；更加值得注意的是，Cas12家族中的Cas12f （Type V-F）是已知尺寸最小的核酸酶，Cas12k （Type V-K）拥有转座酶的特性，Cas12l （ Type V-L）可以在25℃~65℃均表现切割活性。这些多样化的特性，使得Cas12家族表现出强大的应用潜力。
为便于新进入该领域的研究工作者学习与使用，该综述详细介绍了目前Class II CRISPR基因编辑系统的效应蛋白和crRNA挖掘与确定的方法（图2），为挖掘更多的新V型效应蛋白提供了便利。
图2. Class II CRISPR系统的发现流程图。
Type V效应器的挖掘和开发已取得许多进展，但它们在植物中的应用仍然有限。加速这些工程化的效应器在植物系统中应用，对于拓宽植物基因编辑工具包至关重要。通过对多个高活性的氨基酸突变的Cas12变体的分析，和对蛋白质3D结构和平面结构中进行关键氨基酸的标注，发现type V效应子的修饰主要集中在DNA/RNA结合域，这些氨基酸通常位于DNA/RNA分子的几个Å（ångströms）内（图3）。这为未来效应器工程和修改提供了宝贵的见解。
图3. V型效应器工程改造的现状。A. AsCas12a 的工程化改造 B. LbCas12 的工程化改造。C. Cas12c 的工程化改造。D. Cas12f 的工程化改造。E. Cas12i 的工程化改造。某些氨基酸无法在 PDB 数据库的蛋白质模型中显示。
除了结构和分类上详细的总结，本文还侧重于归纳type V效应器在植物和动物中的多种应用的现状，包括它们作为碱基编辑器（BE）、调节基因表达的工具、基因打靶（GT）和生物传感器（图4）。
图 4. V 型效应器的生物学应用。A. Type V效应子（Cas12蛋白）和Cas9蛋白之间的差异。B. 基于Cas12的碱基编辑工具原理。C.基于Cas12的基因表达调控原理。D. CRISPR 相关转座酶 (CAST) 的原理。E. 基于 Cas12 的植物生物传感器。
综上，深度学习和蛋白质从头设计的整合在加速 Cas 效应系统的开发方面具有巨大的前景，并有助于创建具有增强功能的基因操作工具。与针对几个关键氨基酸突变相比，对Cas12的关键肽段或三维结构进行更精细的优化或重新设计可以实现更大、更精确的调整。这种方法通常需要更强大的预测和计算能力。利用人工智能辅助设计代表了一个非常有前途方向。此外，Cas12家族成员相对保守但功能多样且结构紧凑，有利于目标蛋白的从头设计。鉴于基因编辑在修改遗传信息方面的重要意义，Cas12 具有成为未来蛋白质设计和工程化改造与应用平台的巨大潜力（图5）。
图5. 基于Cas9和Cas12系统的基因编辑工具箱为生物传感器、表观遗传编辑器、基因打靶、基因敲除、碱基编辑器甚至植物组织特异性基因编辑提供了全面的解决方案。
博士生张瑞祥，博士后柴楠为论文的共同第一作者，祝钦泷研究员与刘耀光院士为论文的共同通讯作者。林秋鹏教授和谢先荣副研究员参与了论文的讨论。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、广东省基础与应用基础研究重大项目和广东省“十四五”农业科技创新十大重点项目的资助。
