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华东理工大学解永涛：酶催化的高烯醇化醛的不对称加成用于β-手性羟基膦酸酯的高效合成

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2025-02-02 15:28

正文

▲第一作者：李焕功

通讯作者：解永涛

通讯单位：华东理工大学生物工程学院

论文DOI：10.1021/jacs.4c11957 （点击文末「阅读原文」，直达链接）

研究背景

β-手性羟基膦酸/酯是一类广泛存在于医药、农药和天然产物中的优势活性骨架。传统合成方法主要依赖于酯酶或有机催化剂介导的外消旋醇或酯的动力学拆分（KR），产物的理论收率低于50%。尽管已经存在多种不对称还原方法可以用来构筑该类结构，但这些方法存在底物制备路线长、效率低等问题。近日，华东理工大学生物反应器工程全国重点实验室解永涛课题组（张立新团队）通过亲核试剂对高烯醇化的2-膦酸酯乙醛进行不对称加成，实现了基于碳碳键偶联策略的β-手性羟基膦酸酯的高效构筑。该策略是β-手性羟基膦酸理想的合成方法（原料廉价易得、产物结构容易多样化），但确面临很大的挑战：（1）高烯醇化醛α位的氢具有较强酸性，可以导致亲核试剂的失活；（2）高烯醇化醛容易发生aldol类型的副反应；（3）缺乏有效的“驯服”高烯醇化醛的不对称合成策略；（4）高烯醇化醛自身的不稳定性。

工作简介

面对以上挑战，解永涛课题组通过重塑 ThDP依赖酶功能，成功实现了高烯醇化醛的不对称加成反应用于合成β-手性羟基膦酸酯。该方法：①采用原位生成的动态可逆的acyl anion作为亲核试剂，避免了亲核试剂被酸性氢淬灭；②利用酶活性空腔精准的底物识别及非共价键作用，可以实现产物高效、高选择性合成；③对于ThDP依赖型酶催化的Benzoin反应的立体互补合成长期以来都是一个挑战，因为天然酶基本给出的都是R构型产物，缺少可以给出另外一种构型的酶（缺少可以实现立体互补的一对酶）。该研究发现PfBAL以及PaBAL是一对立体互补的酶，将为后续各种Benzoin类型反应的立体互补合成提供了可能；④该反应无需对酶进行纯化，采用细胞裂解液或者全细胞即可催化反应的进行。并且可以实现克级规模的产物合成以及产物可以进行后续的多样性转化；⑤对于拥有类似功能的氮杂环卡宾（NHC）有机小分子催化的该反应，存在产率低、副产物多、立体选择性差等缺点，这进一步证明了酶催化的高效性及高选择性等优势。

主要研究内容

作者首先对野生型的酶进行考察，找到了具有反应活力的PfBAL以及PaBAL，并且两个酶可以给到相反的构型，这为β-手性羟基膦酸的立体互补合成提供了可能（Scheme 2）。随后作者通过定向进化改造以及条件优化，实现了产物的高效、高选择性合成。

Scheme 2野生型酶的考察及酶的改造

作者又进行了底物的拓展，发现无论是PfBAL还是PaBAL催化，都具有较广的底物范围，可以兼容二十几种不同电性及位阻的底物，并给出较高的产率以及对应选择性（Scheme 3）。所生成的产物基本都是全新的手性碳磷化合物，为后续活性研究提供了分子库。值得一提的是，该反应无需对酶进行纯化，采用细胞裂解液或者全细胞即可催化反应的进行。

Scheme 3 底物范围考察

作者进一步采用氮杂卡宾(NHC)有机小分子催化剂催化该反应的进行，结果表明NHC催化很不理想，存在产率低、副产物多、立体选择性差等缺点，这进一步证明了酶催化的高效性及高选择性等优势（Scheme 5）。

Scheme 5 NHC有机小分子催化

作者接下来又进行了机理实验（Scheme 5）。通过进程曲线，作者发现对于PfBAL来说，会快速生成两分子苯甲醛自身缩合的Benzoin副产物，但是该副产物会随后会进一步转化为产物。但是，对于PaBAL来说，该体系并没有Benzoin副产物的生产。作者又将分离纯化的产物置于酶反应液当中，24h后又检测到了原料苯甲醛的生成，证明了该反应是可逆的。

Scheme 6机理相关实验

最后作者通过动力学模拟（MD）来进一步解释两个酶立体互补机制，可以发现PfBAL和PaBAL它们的催化口袋朝向不同，这有可能是两个酶具有相反立体选择性的原因。动力学模拟表明在PfBAL中，acyl anion中间体在催化区域会从Si面进攻2a，得到S构型产物3a，并且四个氨基酸残基(G394, A395, L396, 和 L399) 会阻碍2a进一步深入空腔生成R产物。相反的是，在PaBAL中，acyl anion会从Re面进攻底物2a，有五个氨基酸残基(H32, G33, G34, H35, T79)会阻碍2a进一步深入空腔使acyl anion从Si面进攻底物2a。同时，氨基酸残基398G会和2a形成氢键，更有利于产生R构型产物（Scheme 5）。

Scheme 7活性催化区域剖面图和分子动力学模拟

总结与展望

总之，作者成功开发了一种新型的高烯醇化醛的不对称偶联体系，用于β手性羟基磷酸酯类化合物的高效合成。这种酶介导的反应是小分子NHC催化剂难以实现的。同时该反应可以实现克级反应以及产物多样性转化，为后续新型有机膦药物开发提供了新的机会。该成果近期发表于Journal of the American Chemical Society，文章的第一作者是华东理工大学生物工程学院博士后李焕功博士。该研究工作得到了华东理工大学张立新教授、南洋理工大学/贵州大学池永贵教授的指导，并得到了国家自然科学基金、科技部重点研发计划和中央高校基本科研业务费等项目的资助。目前，解永涛课题组开展的研究方向为：1.基于化学原理，开发自然界不存在的非天然生化反应; 2.基于非天然反应构筑人工生物合成路径。未来，该课题组将解锁更多的天然酶没有的新功能，实现化学催化剂难以实现的转化；并将非天然反应用于构筑天然药物的人工合成途径，简化代谢通路、实现生长与生产的解耦以及产量的提高。

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