Cell | COOL1 基因的自然突变增强了玉米的耐寒性，以适应高纬度地区 中国农大

研究背景

自然变异为提高玉米耐寒性提供了遗传资源。 转录因子 ICE1 和 HSF21 通过调节氮代谢和脂质代谢分别增强玉米幼苗和萌发阶段的耐寒性 🌡️ 。此外， 与膜运输、钙通道和转录因子相关的多个位点也被发现与玉米耐寒性有关 。 DREB1 转录因子在多种植物中具有进化保守的耐寒性调控作用，而 ZmRR1 和 bZIP68 则依赖于 DREB1 调控玉米耐寒性，其蛋白稳定性受激酶 MPK8 调节 🔧 。值得注意的是， ZmRR1 和 bZIP68 的有利等位基因已被证明可显著提升玉米耐寒性。尽管已有这些进展，玉米耐寒性的复杂机制及其适应策略仍需进一步研究 🔍 。

本研究通过对 205 份来自温带和热带/亚热带地区的玉米自交系 进行 GWAS 分析 📊 ，鉴定出 COOL1 负调控玉米的耐寒性。 其启动子自然变异通过影响转录因子结合调控表达，其稳定性由 CPK17 磷酸化控制，耐寒等位基因推动了玉米向高纬度地区的适应性扩张 🌍 。

结果

为探究玉米幼苗耐寒性的遗传基础 🧬 ， 对 205 份包含 88 份热带 / 亚热带（TST）自交系、75 份温带（分为硬秆（SS）和非硬秆（NSS）类型）自交系及 42 份混合来源自交系的玉米材料进行研究 。将幼苗低温处理，通过 相对叶损伤面积评估耐寒性 。发现 SS 亚群耐寒性最高 📈 ，TST 亚群表型变异大 。

利用覆盖全基因组的 1150 万个 最小等位基因频率（MAF）至少为 0.05 的单核苷酸多态性 （SNP）进行 GWAS 筛选导致耐寒性变异的基因位点 🔍 。在 3 号染色体检测到显著峰，其中五个 SNP 与相对叶损伤程度显著相关 ❗ ，这些 SNP 均位于 bHLH 转录因子的 COOL1 （ Zm00001d040148，ZmbHLH76 ）基因启动子区域 （图1 A-B）。 重新测序 COOL1 及其上下游区域并分析变异后 ，发现 另外四个位于启动子的 SNP 与相对叶损伤面积关联更强 💪 ，这九个 SNP 处于强 LD（图1 C），据此将 205 份玉米基因型分为 HapA 和 HapB 两种单倍型， HapB 组相对叶损伤面积显著高于 HapA 组 （图1 D） 。表明 HapA 为耐寒等位基因，HapB 为冷敏感等位基因，且 HapB 组中 COOL1 基础和冷诱导表达水平高于 HapA 组 （图1 E） ，说明 COOL1 表达与耐寒性呈负相关 📉 。

构建近等基因系（NIL）和转基因植株进一步验证 🔬 。 NIL - COOL1 HapA 植株耐寒性强于 NIL - COOL1 HapB 植株且 COOL1 表达水平更低 （图1 F-H）； 在 LH244 背景下过表达 COOL1 的植株耐寒性显著降低 （图1 I）， 冷处理后 相对叶损伤面积增大、离子泄漏增加 （图1 J-L）； 基因编辑株系 cool1 突变体耐寒性增强 ，且 F1 代杂交结果表明 其耐寒性增强是由于 COOL1 功能缺失 ❌ （图2 K-M）。此外，NIL - HapA 和 NIL - HapB 植株以及野生型、COOL1 - OE 和 cool1 突变体植株在冷胁迫下种子萌发无显著差异 🌱 。综上， COOL1 是玉米幼苗耐寒性的负调控因子。

图1 COOL1 的自然变异与玉米幼苗的耐寒性有关

分析 COOL1 启动子上关联 SNP 周围序列，发现 四个处于完全连锁不平衡（LD）的关键 SNP 位于 bZIP 转录因子 HY5 的结合位点 A - box 基序内 🧬 （图2 A）。同时观察到 冷处理下 HY5 表达上调 ，暗示 HY5 与 COOL1 的耐寒性有关 （图2 B）。

为进一步探究其在耐寒性中的作用，构建了 Ubi 启动子驱动的 HY5 过表达转基因植株（HY5 - OE）和 hy5 突变体。 HY5 - OE 植株耐寒性增强，hy5 突变体则更敏感 ⚠️ ， 等位基因测试 证明 hy5 突变体的冷敏感性是由于 HY5 功能缺失 （图2 C-F）。 ChIP-qPCR 表明 HY5 与 COOL1 HapA 启动子上 A - box 的结合亲和力显著高于 HapB 启动子 （图2 G）； EMSA 显示重组 GST - HY5 蛋白与 COOL1 HapA 探针结合强于 HapB 探针 🔬 （图2 H）。表明 COOL1 启动子 A-box 基序内的四个 SNP 影响 HY5 等 bZIP 转录因子的结合。

LUC 实验表明 ，单独转染 COOL1 HapA pro:LUC 相对 LUC 活性低于 COOL1 HapB pro:LUC ，且与 HY5 共转染后 ， COOL1 HapA pro:LUC 相对 LUC 活性显著降低，冷处理后进一步下降，而 COOL1 HapB pro:LUC 相对 LUC 活性不受 HY5 及冷处理影响 （图2 I）。此外，在植物体内， 冷胁迫下 hy5 突变体中 COOL1 表达升高，HY5 - OE 中降低 （图2 J），且 共表达 HY5 和 COOL1 的转基因植株类似 COOL1 - OE 表现出冷敏感性增加 （图2 K-L）， cool1 hy5 双突变体在相对叶损伤面积上与 cool1 单突变体相似 （图2 M-N）。

综上， COOL1 启动子的自然变异影响 HY5 结合，HY5 可负调控 COOL1 表达，从而正向调控玉米耐寒性 。

图2 COOL1 启动子的自然变异影响 HY5 的结合亲和力

为鉴定 COOL1 调控的 COR 基因， 对野生型和 cool1-1 突变体幼苗在冷或 CK 处理后进行 RNA - seq ，在野生型幼苗中鉴定出 9934 个在转录水平有显著变化的冷响应（COR）基因 ❄️ ，同时确定了 5241 个 COOL1 调控基因， 其中 2881 个与 COR 基因重叠 ，定义为 COOL1 调控的 COR 基因（图3 A-B）。 GO 分析显示 这些 基因在 “对氧的响应”“对温度的响应”“光合作用” ☀️ 以及 “转录” 和各种代谢过程等生物过程中富集。

利用冷处理的 COOL1-GFP 转基因幼苗进行 ChIP-seq 来确定 COOL1 的直接靶标 🎯 ，识别出 12385 个显著峰对应 6839 个基因，其中 56.47% 位于核心启动子区域（图3 C）， 结合位点的基序分析 表明 G - box（CA/GCGTG）是得分最高的基序 （图3 D）。通过 RNA-seq 和 ChIP-seq 结果交集 ， 确定了 1408 个 COOL1 直接靶基因，GO 富集分析显示这些基因主要与 “对非生物胁迫的响应”“转录因子活性”“DNA 结合” 和 “RNA 代谢过程” 相关 🌪️ （图3 E）。ChIP - seq 分析发现 COOL1 结合到编码关键转录因子 DREB1s （正向调控玉米耐寒性）和 TPS （其编码的酶参与渗透调节物质海藻糖的生物合成）的启动子上 🌽 。

进一步验证发现， cool1 - 1 中 DREB1 基因（ DREB1.1-10 ）的冷诱导表达显著高于野生型 📈 ，RT-qPCR 进一步验证了冷处理后 cool1 突变体中 DREB1.10 和 TPS13 表达上调，在 COOL1-OE 系中下调。 ChIP-qPCR 表明 COOL1 - GFP 主要结合到 DREB1.10 启动子的 P1（G-box）和 P2/P4（CACGCG）区域以及 TPS13 的 P2P4 区域 （图3 F-G）； EMSA 表明 COOL1 在体外直接结合到 DREB1.10 和 TPS13 启动子 （图3 H-I）； 双 LUC 实验 表明 COOL1 抑制 DREB1.10 和 TPS13 启动子活性，且与冷处理无关 （图3 J-K）。此外， 过表达 TPS13 的玉米植株耐寒性增强 💪 （图3 L-N）。

综上， COOL1 可直接靶向 DREB1 和 TPS 基因并抑制其表达，从而负调控玉米耐寒性。

图3 DREB1 和 TPS 基因是 COOL1 的直接靶标

COOL1 的 表达模式显示 ， COOL1-GFP 主要定位于细胞核和细胞质，冷处理不改变其定位， COOL1 在根和茎中均有较高转录水平，冷处理会使 COOL1 的转录和蛋白水平增加 📈 （图4 A-B），且 在 COOL1过表达幼苗冷处理后其蛋白水平也升高 （图4 C），表明 冷胁迫可稳定玉米中 🌽 的 COOL1 蛋白。

为探索在冷胁迫下调节 COOL1 蛋白稳定性的因素， 在表达 COOL1-GFP 的玉米原生质体中进行 LC - MS/MS 分析 🔬 ， 鉴定出 CPK17 为 COOL1 的互作蛋白 。酵母双杂交、pull - down 和 co-IP 实验证实了二者的相互作用（图4 D-E），BiFC 实验表明二者 在 25°C 时主要在细胞质相互作用，冷处理后转至细胞核 （图4 F）。表明 CPK17 可能在冷期间调节 COOL1 功能 。

构建 Ubi 启动子驱动的 CPK17 过表达转基因植株（CPK17 - OE）和 cpk17 缺失突变体进行耐寒性测试，结果显示 CPK17 - OE 植株耐寒性显著降低 ⚠️ （图4 G-I）， cpk17 突变体耐寒性增强 （图4 J-L），且 cpk17 - 1 和 cpk17 - 2 杂交的 F1 代幼苗耐寒性与 cpk17 单突变体相当 ，表明 CPK17 是玉米幼苗耐寒性的负调控因子 🌽 。

推测 COOL1 是 CPK17 磷酸化底物 🧬 。后进行 体外磷酸化实验 表明， CPK17 不仅具有自磷酸化活性，还能磷酸化 COOL1 （图5 A）。通过 LC - MS/MS 分析 确定 Thr-124 为 COOL1 的候选磷酸化位点，将其突变为 Ala（COOL1 T124A）后，CPK17 对其磷酸化作用大幅降低 📉 （图5 A），证明 CPK17 在体外可磷酸化 COOL1 的 Thr-124 位点 。

在玉米原生质体和转基因植株中均检测到对应 COOL-GFP 的两条带，且 经碱性磷酸酶处理后迁移较慢的带消失 ，表明 COOL1 在植物体内也被磷酸化 🌱 ，且 LC - MS/MS 分析确认 Thr-124 是体内磷酸化位点 （图5 B）。 凝胶内激酶实验 显示 冷胁迫诱导野生型幼苗中 CPK17 激酶活性，CPK17-OE 幼苗中该活性显著增强，cpk17 突变体中大幅降低但仍有残余信号 📉 （图5 C）。表明 其他激酶可能也参与冷胁迫下 COOL1 的磷酸化。

亚细胞定位 表明 冷处理使 CPK17-GFP 从细胞质转移到细胞核 🧬 ，细胞分级分离实验和共聚焦显微镜观察也证实了这一点（图5 D-F）。通过 无细胞降解实验来评估 CPK17 是否通过磷酸化调节 COOL1 稳定性 。结果显示， 在有 ATP 存在时，与 CPK17-OE 植株中 GST - COOL1 降解变慢慢 ⏳ ，cpk17 中降解更快，且 GST - COOL1 T124A 变体蛋白降解比 GST - COOL1 更快，二者降解均受 MG132（26S 蛋白酶抑制剂）显著抑制 （图5 H）。表明 CPK17 介导的磷酸化可防止 COOL1 被泛素介导的降解。 此外，随着 CPK17-MYC 表达增加，COOL1-GFP 水平升高，但 COOL1 T124A - GFP 水平无变化，WB 也显示冷诱导的 COOL1 蛋白水平在 CPK17-OE 幼苗中更明显增加 📈 ，在 cpk17 - 1 中降低（图5 I）。进一步证明 CPK17 通过磷酸化增强 COOL1 稳定性 。

对 cpk17 - 1、COOL1 - OE 和 cpk17 COOL1 - OE 幼苗的耐寒性评估发现， cpk17 突变体耐寒性增强 💪 ，COOL1-OE 幼苗更敏感，cpk17 COOL1-OE 幼苗在耐寒性和离子泄漏方面与 COOL1-OE 幼苗相似 （图5 J-K）。表明 CPK17 通过调节 COOL1 蛋白稳定性负调控耐寒性 🌽 。

图5 CPK17 在冷胁迫下磷酸化并稳定 COOL1

为探索 COOL1 的进化起源 🌱 ， 对 59 个不同的玉米品系中 COOL1 变体周围的启动子区域进行了测序 。发现 大部分栽培和野生型材料都携带耐寒的 COOL1 HapA 等位基因 ，表明 该变异是玉米野生近缘种中预先存在的遗传变异 。

对 1008 份代表美洲玉米地方品种的材料进行 COOL1 等位基因分型 ，发现 COOL1 与纬度密切相关 🌍 ，耐寒的 COOL1 HapA 等位基因在高纬度地区频率更高，冷敏感的 COOL1 HapB 等位基因在低纬度地区更常见 （图6 A-C）。进一步分析表明 COOL1 HapA 主要集中在北美高纬度地区 ，在美国其频率几乎固定，而在南美洲未检测到显著关联。

COOL1 变体的分布表明 其可能在促进玉米适应北美温带地区和高纬度寒冷气候方面发挥了重要作用 ，同时也凸显了玉米野生近缘种作为遗传资源在拓宽玉米遗传基础和打破育种瓶颈方面的重要价值 💎 。

图6 COOL1HapA 等位基因有助于玉米的高纬度适应

讨论

本研究 Discussion 部分主要讨论了以下内容：

COOL1 在玉米耐寒及纬度适应中的关键作用 ：COOL1 是玉米耐寒性的关键调控因子， 其启动子的自然变异影响 HY5 结合，致使 COOL1 表达改变，进而影响耐寒性 📉 。冷激活的 CPK17 通过磷酸化稳定 COOL1，COOL1 又抑制下游 DREB1 和 TPS 等基因表达来负调控耐寒性，且 COOL1 HapA 单倍型在高纬度地区频率较高 ，表明其在玉米适应高纬度寒冷气候中起关键作用，这揭示了玉米耐寒性的一种新调控模块（图7） 💡 。

COOL1 与玉米地理适应的关联 ： 玉米从热带向高纬度地区传播需适应低温环境 ❄️ ，COOL1 的自然变异为其提供了适应基础 。 COOL1 HapA 等位基因在玉米进化过程中早于 parviglumis 和 mexicana 的分化 ，其在美洲地方品种中的分布频率与纬度相关 📊 ，在北美高纬度地区的高频率表明它在玉米适应温带气候中具有重要意义，类似的自然变异在水稻驯化中也有体现，凸显了野生种遗传变异对作物地理适应的重要性。

COOL1 相关调控模块的意义 ：HY5 对 COOL1 的负调控以及 CPK17 对 COOL1 的磷酸化稳定，构成了复杂的调控网络 🌐 。HY5 与光信号相关，表明 光和温度信号通过 HY5 - COOL1 模块相互作用，增强玉米对不同气候的适应能力 ，这种调控模块在植物中具有进化保守性，体现了植物应对环境胁迫的精细调控机制。

COOL1 等位基因在育种中的应用潜力及研究局限 ：COOL1 的耐寒等位基因 COOL1 HapA 有望用于提高玉米在寒冷地区的耐寒性和适应性，且在非胁迫条件下，COOL1 功能缺失不影响产量相关性状，为其在育种中的应用提供了优势。然而，研究也存在局限，如尚未明确 COOL1 对光和光周期的响应机制 🌞 ，且耐寒性评估仅在温室条件下进行，未来需要开展田间试验以全面评估其在实际农业生产中的应用潜力 🔍 。

研究思路

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• 通讯作者 ：

  Shuhua Yang ( [email protected] )
• 主要作者：

  Rong Zeng, Yiting Shi, Li Guo, Diyi Fu, Minze Li

• 作者单位：

  1. State Key Laboratory of Plant Environmental Resilience, Frontiers Science Center for Molecular Design Breeding, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China.

• 2. State Key Laboratory of Plant Environmental Resilience, Frontiers Science Center for Molecular Design Breeding, National Maize Improvement Center, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize (MOA), Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, China Agricultural University, Beijing 100193, China.

• 3. State Key Laboratory of Plant Genomics and National Plant Gene Research Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China.

1. 文章内容较长， 请大家耐心读完！

   
   

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