今天给各位介绍这一篇近期发表在PROTEIN & CELL上的文章，该团队收集4名患者(其中3名患有子宫腺肌病，1名患有子宫肌瘤)的子宫内膜(EnD)、子宫内膜-肌层交界处(EnJ)、异位病变(EnC)和子宫肌层(EnM)等共15个组织样本进行scRNA-seq测序，最终获得 54,658 个细胞，共同探究子宫腺肌病的病变转录图谱。究竟怎么样，我们一起看看吧！
一、研究背景
子宫腺肌病作为临床常见的妇科疾病之一，目前对其的了解仍知之甚少，因此缺少有效的治疗手段。子宫内膜-肌层连接处(EMJ)是连接子宫内膜和子宫肌层的纽带，对子宫腺肌病的诊断和分型具有重要意义，但对EMJ的研究才刚刚开始。
二、实验结果
图1.
1、单细胞测序探索子宫腺肌症的细胞图谱
该团队首先收集了4名患者(其中3名患有子宫腺肌病，1名患有子宫肌瘤)的子宫内膜(EnD)、子宫内膜-肌层交界处(EnJ)、异位病变(EnC)和子宫肌层(EnM)共15个组织样本进行single-cell RNA测序(图1A-B)，最终获得 54,658 个细胞，并根据已知标记物的表达鉴定了15种细胞类型(图1C-E)。分析子宫腺肌症与对照中不同子宫区域的细胞组成发现，上皮细胞和基质细胞主要位于EnD、EnC和EnJ中，在EnM中没有发现，而子宫腺肌病EnJ区的大多数细胞类型是成纤维细胞、肥大细胞、平滑肌细胞和血管祖细胞(图1F)。与对照相比，子宫腺肌病样本的EnJ中血管祖细胞和小静脉内皮细胞富集(图1G)。在EnC中，存在着包括STEAP4+血管周围细胞、动脉EC和静脉EC以及T细胞的富集，这表明血管和免疫异常细胞可能在子宫腺肌病的发展中发挥重要作用(图1G)。
图2.
2、上皮细胞特异性基因表达及特征亚群
接着该团队利用空间转录组技术结合scRNA-seq数据来展示子宫腺肌病的整体情况。结果表明，子宫腺肌病的病变中，上皮细胞被基质细胞包围，STEAP4+血管周围细胞在异位病变区域富集，表明血管生成微环境可能有助于子宫腺肌病的进展(图 2A)。上皮细胞分为纤毛细胞和无纤毛细胞亚群，它们在EnC、EnJ、EnD等区域中的分布是一致的，但它们的基因表达不同。如EnC上皮细胞特异表达与迁移、血管生成和增殖相关的基因，富集到TNF、MAPK等信号通路。相比之下，EnJ上皮细胞特异表达与细胞生长和细胞基质粘附有关基因(图2B-D)。值得注意的是，LGR5+细胞在ENC的上皮细胞中显著丰富(图2E)，并通过qRT-PCR、IF等方法验证了这一结果(图2F-H)。LGR5是成体干细胞的标志，表达LGR5的干细胞对子宫腺上皮的发育至关重要，LGR5基因也被认为是WNT信号通路的典型靶点。因此，研究人员假设LGR5+干/祖上皮细胞是异位病变的特征亚群，LGR5/WNT信号通路可能与子宫腺肌病有关(图2K)，WNT信号通路相关的基因(SOX9、MSL1、MMP7)在EnC中显著上调(图2L)。
图3.
3、基质细胞和特征亚群
为了将基质细胞进一步细分，该团队鉴定出5个基质细胞亚群和2个成纤维细胞亚群(图3A)，但基质亚群的分布在子宫中并不相同(图3B)。基质细胞cluster 0显著高表达APCDD1、HOXA11、PTCH1等基因，富集细胞分化和WNT信号通路；而cluster 3富集Ubl结合和蛋白质折叠；cluster 4的特征是表达WFDC1、EEF1B2、SFRP5，富集典型细胞质翻译。值得注意的是，cluster 2 是子宫腺肌病EnC所独有的，表达ENPP2、PKIB、ITM2B、ALCAM 、FBXO32等基因，与细胞生长、细胞迁移和血管发育有关(图3C-F)。由于基质cluster 2是病变特异性亚群，研究人员先通过qRT-PCR验证其特异性表达基因ENPP2和PKIB。结果表明，与EnD中对照和子宫腺肌病患者的基质细胞相比，异位基质细胞中这两个基因显着上调(图3E)，PKIB+和ENPP2+基质细胞也独特分布在异位病变的上皮细胞周围(图3G)。FISH、IF也进一步验证了基质cluster2的存在和组织学分布(图3H-J)。图4.
4、基质细胞和祖基质细胞的分化轨迹
为了深入了解基质细胞的分化，该团队生成了基质亚群的RNA速度图，预测三种发育轨迹，其中三名子宫腺肌病患者的轨迹方向保持完全一致(图4A-B)。基质cluster 4细胞位于轨迹的起点，表明基质cluster 4是祖基质细胞。基质cluster 4向cluster 0，随后到cluster 3表示正常的子宫内膜路径(EnD路径)，基质cluster 4向cluster 2 表示异位病变路径(EnC路径)，基质cluster 4向cluster1表示子宫内膜-肌层交界处路径(EnJ路径)(图4C)。接下来，该团队进一步分析了细胞亚群之间和速率轨迹上的差异表达基因，在祖基质细胞中检测到SFRP5显著上调，主要位于基质cluster 4内(图4D-E)。而EnD路径中，与WNT信号通路相关的基因(APCDD1、VWC2、WNT5A、WNT4)和子宫发育基因(HOXA10、HOXA11、FOXL2)上调。在EnC路径中，ENPP2、PKIB、WNT16和NELL2的表达水平增加(图4D-E)，并通过qRT-PCR进行了验证(图4F)。为进一步鉴定cluster 4的特征基因，发现WFDC1主要在cluster 4中表达并与炎症、修复和细胞迁移相关(图4G)。WFDC1+细胞主要富集于子宫腺肌病的EnD、EnJ和EnC中(图4H)。通过FISH和IHC染色进一步验证发现，WFDC1主要表达于子宫腺肌病的EnC和EnJ区域(图4I-K)。
图5.
5、内皮细胞多样性和血管生成
接着该团队将内皮细胞(EC)进行亚群的细分，鉴定出7个亚群。EC毛细血管簇主要分布在EnC、EnJ和EnM，并且在对照组和子宫腺肌病组中相似(图 5A-B)。此外，基因表达分析揭示了不同子宫腺肌病区域中免疫相关和血管生成相关基因的差异上调。例如，在EnJ中，与趋化因子(CCL23、CCL21)和免疫反应(TNFSF9、CTSC)相关的基因表达增加。在EnD中，血管生成相关基因(ARHGDIB、GNAS)上调(图5C-E)。此外，还进一步揭示了各种细胞类型中不同的血管内皮生长因子(VEGF)的表达(图5F)。在EC-TIP细胞的ENC中，ANGPT和VEGF受体TIE1、FLT1、KDR的上调表明血管生成活跃(图5G)。此外，ANGPT-TIE轴对血管生成至关重要，在子宫腺肌病的ENC中观察到ANGPTL等信号存在广泛细胞间通讯(图5H)。
图6.
6. 子宫腺肌病中的异常细胞连接
最后，该团队通过细胞通讯分析子宫腺肌异位和在位子宫内膜组织中细胞间的相互作用。结果显示，在EnC中基质细胞、成纤维细胞和EC之间的相互作用减少，而平滑肌细胞与其他细胞类型的相互作用增加(图6A-B)。在EnC中，PTN和TWEAK是主要的输出信号，主要由成纤维细胞和MYH11+血管周围细胞分泌(图6E-6F)。此外，还观察到FGF、IL6和BAG通路，这些信号通路与细胞增殖、血管生成和免疫反应有关，促进了异位病变的进展。相反，END显示SPP1和HH途径的富集，与子宫内膜容受性和间质细胞活动相关(图6H)。WNTs、IGFS、TNF等关键信号通路在ENC和END中的表达存在差异。MKI67+细胞、成纤维细胞和间质分泌的WNTs和IGFS在ENC中明显减少(图6G)。特别是巨噬细胞和T细胞的CSF、LIFR、IL2信号通路的通讯也发生了变化。
三、总结
本研究使用单细胞RNA测序联合空间转录组学，绘制了在位内膜、病变和内膜-肌层连接处之间的转录变化图谱。在病变内，确定了独特的上皮亚群(LGR5+)、侵袭性间质(PKIB+)亚群以及WFDC1+祖细胞。此外，还观察到内皮细胞的异质性和涉及血管内皮生长因子和血管生成素通路的异常血管生成信号。异位内膜和在位内膜之间的细胞-细胞通讯明显不同，在涉及多营养素、TWEK和WNT级联等病变中有异常信号。这项研究揭示了子宫腺肌病病变中独特的干细胞样细胞和侵袭性细胞亚群，信号功能障碍和EMJ异常对于制定精确的诊断和治疗策略至关重要。更多详情还请大家移步原文，仔细品鉴。
