对于很多生化科研人而言，蛋白质印迹法（Western blotting，WB）可能是其使用最广泛的技术之一。每个人或多或少都有点 WB 血泪史，总有一段被 WB 弄得欲哭无泪的黑暗时光。今年，WB 迎来了第 45 个生日，正值壮年、坐拥蛋白质研究技术的「头把交椅」 的它毁誉参半，爱它者甘之如饴，恨它者批评质疑。作为一项检测特定蛋白质的有效方法，操作步骤繁琐、费用相对经济的 WB 为科学史的发展立下汗马功劳。以往不少人的惯有做法是裁剪凝胶或 WB 图像，裁剪过程会去掉图像中无关的部分，只呈现感兴趣的蛋白质。然而，凝胶和 WB 图像的裁剪可能会出现问题，负面评价也随之而来，WB 不可避免地成了造假重灾区。令人心惊的是，著名论文打假侦探 Elisabeth Bik（发现曹雪涛问题论文）曾和团队扫描了 1995 - 2014 年间发表的 2 万多篇涉及 WB 的学术论文，发现近 4%（782 篇）的论文都存在至少一张数据图的不恰当复制和使用。来源：Gabriela Hasbun for NaturePLOS ONE 曾对 2017 年到 2019 年伦理组处理的所有图像问题进行统计，发现 WB 图像问题位居首位，引得人们密切关注。因此，早在 2019 年 7 月 1 日开始，PLOS ONE 和 PLOS Biology 杂志均要求作者提供 WB 的原始数据，必须提供原始的，未剪切和最小化调整的图像，否则将对其实施拒稿操作。如此强有力的举措势必将让更多的「妄图蒙混过关者」望而却步！2024 年，著名的临床医学期刊 JCI（Journal of Clinical Investigation）及旗下子刊 JCI Insight 要求，含剪裁 Blot/Gel 图像需提交包含所有裁剪印迹和凝胶未编辑图像的文件，还需要标注「图 [X] 的完整未编辑 Blot/Gel」 及对应通道。上述强有力的投稿要求足以见学术界苦 WB 图片造假久矣，需要出手整顿 WB 实验乱象，既为 WB 正名，又维护学术公平和清朗。所谓成在 WB，败也在 WB。不少国内外研究人员曾因 WB 实验图片出现问题，引发撤稿潮，严重地损伤个人学术羽毛。近日，西安交通大学第二附属医院某团队 2018 年发表在 J Cell Biochem 杂志的论文被撤回，因为 WB 条带剪接、图片重复。撤稿理由之一是编辑在论文图 5A 所示的 WB 实验中检测到不恰当的图片采集和剪接。由于编辑对所呈现数据的整体准确性失去了信任，并认为结论无效，该文章已被撤回。无独有偶，江苏大学医学院某团队 2017 年发表在 Cell Biol Toxicol 杂志的论文因 WB 条带存在剪切痕迹撤回。历时多年后，不知当时的作者们面对此情此景，内心该做何感受？或许当时只为了图片更优美、数据差异性更大，却无形之中触犯到学术造假的底线，真理永远不会迟到，这样的操作最终导致撤稿。还有一篇关于阿尔茨海默病的研究论文发表十年后，被发现 WB 实验问题后火速撤稿，论文作者之一 Domenico Praticò 和主编在彻底审查后发现图 4B 和图 5A 的肌动蛋白条带使用不当，数据无效，再次引发了人们对科研数据真实性和可靠性的广泛关注和讨论！上述撤稿事件令人心惊且警惕，看来做 WB 的小伙伴们一定要长一万个心眼，才能避免呕心沥血做出的实验成果被拒稿乃至撤稿，不仅阻碍个人科研进展，而且损害学术名誉。首先，应认真阅读各类杂志对于 WB 图片的投稿要求，做到有的放矢，在进行 WB 实验时，将每一个步骤都做到科学合理，留存好完整和原始的凝胶和图像（如下图所示）。避免因为格式上的问题引起编辑误会，从而导致稿件被拒或需返工补充实验。学术期刊多如过江之鲫，如果不知道怎么界定 WB 图片要求，跟着 CNS 期刊要求准没有错。例如，Nature 杂志明确要求提出要提交未经裁剪图像，内参和目的蛋白在同一张膜上，尽量不跑平行胶，以保证实验数据的准确性。Cell 杂志直接提出需要提供实验各个环节的原始数据和图像，如果未按时提交，文章可能推迟发表或存在撤稿风险。Diabetes 杂志明确要求提交所有原始、未裁剪、未编辑的图像文件，包括计划在文章最终版中发表的所有 gels、Western Blots、显微照片等。
下图是部分期刊对于 WB 图片的明确要求，为大家成功投稿保驾护航。
其次，在实验过程中，也要注意 WB 操作的严谨性和科学性。
- 在所有的印迹图像上都应显示或标记 Marker 的分子量位置。
- 应避免印迹的过饱和暴露，以将条带信号强度（以光密度或荧光单位表示）保持在定量的线性范围内。
- 调整对比度和亮度应该是适度的，避免过度处理图片， 否则会导致真实数据信息丢失。
- 不应以任何可能影响所显示的科学信息的方式调整图像。不应修改背景和对比度以明显改变数据、背景或非特定条带的可见性。列出图像处理软件和步骤等，越详细越好。
- 当进行条带之间的比较分析时，所有相关样品应在相同的凝胶/印迹上运行。
如图所示，左图便是作者踩坑啦，很可能在第一关就被编辑拒掉。作为科研工作者，应心怀敬畏，严格地维护学术羽毛，按照 WB 实验要求去完成每一个细节，一定要遵守标准规则，做到原始数据的保留，数据作图的规范，将其作用发挥到最大，而不要被其反噬。大家有什么 WB 经验分享吗，踩过哪些 WB 实验和投稿的坑呢？一起来评论区和学霸君讨论吧！我们长期为科研用户提供前沿资讯、实验方法、选品推荐等服务，并且组建了 70 多个不同领域的专业交流群，覆盖神经科学、肿瘤免疫、基因编辑、外泌体、类器官等领域，定期分享实验干货、文献解读等活动。
添加实验菌企微，回复【】中的序号，即可领取对应的资料包哦～
【2401】论文写作干货资料（100 页）
【2402】国内重点实验室分子生物学实验方法汇总（60 页）
【2403】2024 最新最全影响因子（20000+ 期刊目录）
