m6A甲基化，其实也已经是比较常见的科研方向了，但是这篇北大和清华两位博士生合作发表在45.5分的Cell主刊上的文章，让我发现m6A甲基化在选对了课题的方向，严谨地验证后，还是可以发高分的。今天就来看看他们这篇Cell讲了些什么？
这篇文章主要研究的对象是cenRNA和CENPA，CENPA是一种组蛋白，它主要是在染色体的着丝粒位置上。CENPA对于在有丝分裂期间，着丝粒完整性及其功能有着重要的作用。CENPA控制着染色体的分离，其失调会导致细胞分裂过程中非整倍体的出现，导致肿瘤之类的病变：
他们首先通过MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序），分析了肿瘤样本中染色质相关的RNA，他们通过分析发现肿瘤中cenRNAs（着丝粒RNA）的m6A甲基化产生了异常。敲减了甲基转移酶METTL3后，可以抑制cenRNA的m6A甲基化修饰，同时也降低了着丝粒的稳定性（这里其实就是通过归纳法，分析得到了cenRNA的m6A甲基化修饰，与着丝粒稳定性之间潜在的关联性，不清楚归纳法的话，可以看看《列文虎克读文献》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）：
但是，光是敲减METTL3其实并不能说明问题，直接敲减METTL3除了可以降低cenRNA的m6A甲基化修饰，还可能造成其他的影响（这里如果直接敲减METTL3，并不能得到cenRNA的m6A甲基化修饰能影响，也就是产生了肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。于是他们使用了CRISPR-dCas13b-FTO系统，也就是通过sgRNA定位到cenRNA上，然后通过融合的FTO特异性地去除cenRNA的m6A甲基化修饰，从而避免肯定后件的逻辑谬误。结果发现cenRNA的m6A甲基化修饰增多，的确可保护癌细胞中的着丝粒稳定性：
那么cenRNA的m6A甲基化修饰具体是如何影响着丝粒稳定的呢？通过敲减METTL3后，他们发现染色质结合过程相关的蛋白质有四种发生了显着的减少，其中一个就是CENPA。而通过CRISPR-dCas13b-FTO特异性清除了cenRNA的m6A甲基化修饰后，着丝粒上CENPA的量也明显降低了。那么CENPA的降低是在什么时期发生的呢？他们通过SNAP-Cell TMR-STAR（SnapTag 配体）系统，对CENPA进行共价结合并染色，分析发现CENPA丰度的降低发生在S期。也就是说了cenRNA的m6A甲基化修饰，在S期着丝粒区域CENPA稳定性中，有着重要的作用：
既然要维持CENPA的稳定，那么就要看看cenRNA是否能结合CENPA，通过结合来产生这样的稳定性维持（这个过程其实就是假设迭代的过程，由于前期的研究发现了cenRNA与CENPA之间的关联性，提出这样新的假设，假设两种是通过结合造成了CENPA的稳定性增强，不清楚假设迭代的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。结果发现cenRNA在m6A甲基化修饰后，是可以结合CENPA的。而未甲基化修饰的cenRNA对于CENPA的结合却并不明显：
既然两者的结合是可以证明了，那么具体CENPA与cenRNA结合的位置就是这个问题的关键了。他们通过CENPA的分段克隆和分子对接，确定了CENPA与cenRNA可能结合的位置，通过突变CENPA的两个氨基酸位点，实现了两者结合的阻断（这里其实也就是将两者的结合这个命题，落实在了CENPA结合m6A甲基化修饰的cenRNA的具体位点上，这样更方便后期验证以及逻辑的严谨性，不清楚命题和逻辑的严谨性的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）：
接下去的验证，就集中在了具体的CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合，验证的关键就是两个点，一个是cenRNA的m6A甲基化修饰，另一个就是CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合的关键氨基酸（使用CRISPR-dCas13b-FTO特异性去除cenRNA的m6A甲基化，或者突变CENPA上关键的氨基酸位点，可以阻断CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合，通过阻断结合，来验证对于表型的影响，可以有效避免肯定后件和中项不周延的逻辑谬误，不清楚的话可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。结果也证实了，CENPA-m6A修饰的cenRNA之间相互作用的中断，会导致癌细胞中异常的细胞有丝分裂和基因组不稳定：
最后他们分析了CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合与肿瘤增殖之间的关联性，其实也就是将有丝分裂和基因组不稳定的表型进行了扩大和延伸：
最后就形成了这样的示意图，cenRNA被METTL3进行了m6A甲基化修饰后，可以更好地结合着丝粒上的CENPA。而CENPA通过与m6A甲基化修饰的cenRNA结合，提高了CENPA的稳定性，防止着丝粒产生脆弱性，使得肿瘤细胞增殖明显增加。而破坏了CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA的结合，染色体的着丝点产生脆弱性，导致了异常的细胞有丝分裂和基因组不稳定，抑制了肿瘤的增殖和生长：
这篇文章虽然验证的着眼点并不是特别宽泛，但在关键的节点，进行了反复的特异性的验证，从逻辑的角度是无懈可击的。这可能也就是一篇Cell主刊应该有的样子，好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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