m6A甲基化,其实也已经是比较常见的科研方向了,但是这篇北大和清华两位博士生合作发表在45.5分的Cell主刊上的文章,让我发现m6A甲基化在选对了课题的方向,严谨地验证后,还是可以发高分的。今天就来看看他们这篇Cell讲了些什么?
这篇文章主要研究的对象是cenRNA和CENPA,CENPA是一种组蛋白,它主要是在染色体的着丝粒位置上。CENPA对于在有丝分裂期间,着丝粒完整性及其功能有着重要的作用。CENPA控制着染色体的分离,其失调会导致细胞分裂过程中非整倍体的出现,导致肿瘤之类的病变:
他们首先通过MeRIP-seq(甲基化RNA免疫沉淀测序),分析了肿瘤样本中染色质相关的RNA,他们通过分析发现肿瘤中cenRNAs(着丝粒RNA)的m6A甲基化产生了异常。敲减了甲基转移酶METTL3后,可以抑制cenRNA的m6A甲基化修饰,同时也降低了着丝粒的稳定性(这里其实就是通过归纳法,分析得到了cenRNA的m6A甲基化修饰,与着丝粒稳定性之间潜在的关联性,不清楚归纳法的话,可以看看《列文虎克读文献》和《科研的推理和逻辑:从实验台到咖啡桌》):
但是,光是敲减METTL3其实并不能说明问题,直接敲减METTL3除了可以降低cenRNA的m6A甲基化修饰,还可能造成其他的影响(这里如果直接敲减METTL3,并不能得到cenRNA的m6A甲基化修饰能影响,也就是产生了肯定后件的逻辑谬误,不清楚肯定后件的话,可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼?》系列和《科研的推理和逻辑:从实验台到咖啡桌》)。于是他们使用了CRISPR-dCas13b-FTO系统,也就是通过sgRNA定位到cenRNA上,然后通过融合的FTO特异性地去除cenRNA的m6A甲基化修饰,从而避免肯定后件的逻辑谬误。结果发现cenRNA的m6A甲基化修饰增多,的确可保护癌细胞中的着丝粒稳定性:
那么cenRNA的m6A甲基化修饰具体是如何影响着丝粒稳定的呢?通过敲减METTL3后,他们发现染色质结合过程相关的蛋白质有四种发生了显着的减少,其中一个就是CENPA。而通过CRISPR-dCas13b-FTO特异性清除了cenRNA的m6A甲基化修饰后,着丝粒上CENPA的量也明显降低了。那么CENPA的降低是在什么时期发生的呢?他们通过SNAP-Cell TMR-STAR(SnapTag 配体)系统,对CENPA进行共价结合并染色,分析发现CENPA丰度的降低发生在S期。也就是说了cenRNA的m6A甲基化修饰,在S期着丝粒区域CENPA稳定性中,有着重要的作用:
既然要维持CENPA的稳定,那么就要看看cenRNA是否能结合CENPA,通过结合来产生这样的稳定性维持(这个过程其实就是假设迭代的过程,由于前期的研究发现了cenRNA与CENPA之间的关联性,提出这样新的假设,假设两种是通过结合造成了CENPA的稳定性增强,不清楚假设迭代的话,可以看看《信号通路是什么鬼?》系列和《科研的推理和逻辑:从实验台到咖啡桌》)。结果发现cenRNA在m6A甲基化修饰后,是可以结合CENPA的。而未甲基化修饰的cenRNA对于CENPA的结合却并不明显:
既然两者的结合是可以证明了,那么具体CENPA与cenRNA结合的位置就是这个问题的关键了。他们通过CENPA的分段克隆和分子对接,确定了CENPA与cenRNA可能结合的位置,通过突变CENPA的两个氨基酸位点,实现了两者结合的阻断(这里其实也就是将两者的结合这个命题,落实在了CENPA结合m6A甲基化修饰的cenRNA的具体位点上,这样更方便后期验证以及逻辑的严谨性,不清楚命题和逻辑的严谨性的话,可以看看《信号通路是什么鬼?》系列和《科研的推理和逻辑:从实验台到咖啡桌》):
接下去的验证,就集中在了具体的CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合,验证的关键就是两个点,一个是cenRNA的m6A甲基化修饰,另一个就是CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合的关键氨基酸(使用CRISPR-dCas13b-FTO特异性去除cenRNA的m6A甲基化,或者突变CENPA上关键的氨基酸位点,可以阻断CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合,通过阻断结合,来验证对于表型的影响,可以有效避免肯定后件和中项不周延的逻辑谬误,不清楚的话可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼?》系列和《科研的推理和逻辑:从实验台到咖啡桌》)。结果也证实了,CENPA-m6A修饰的cenRNA之间相互作用的中断,会导致癌细胞中异常的细胞有丝分裂和基因组不稳定:
最后他们分析了CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA结合与肿瘤增殖之间的关联性,其实也就是将有丝分裂和基因组不稳定的表型进行了扩大和延伸:
最后就形成了这样的示意图,cenRNA被METTL3进行了m6A甲基化修饰后,可以更好地结合着丝粒上的CENPA。而CENPA通过与m6A甲基化修饰的cenRNA结合,提高了CENPA的稳定性,防止着丝粒产生脆弱性,使得肿瘤细胞增殖明显增加。而破坏了CENPA与m6A甲基化修饰的cenRNA的结合,染色体的着丝点产生脆弱性,导致了异常的细胞有丝分裂和基因组不稳定,抑制了肿瘤的增殖和生长:
这篇文章虽然验证的着眼点并不是特别宽泛,但在关键的节点,进行了反复的特异性的验证,从逻辑的角度是无懈可击的。这可能也就是一篇Cell主刊应该有的样子,好了,今天就先策到这里吧,有兴趣的话可以看看原文,祝你们心明眼亮。
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