那天在PubMed上冲浪的时候，看到了这么一篇巨噬细胞浸润的空间单细胞转录组的研究，这是陆军军医大学卞修武院士团队，硕士生王文英、博士生李天然等联合发表在50.3分的Cell子刊上的文章。说实话，能发到Cancer Cell上，其实工作量也已经是非常之大了。我们就来看看他们是怎么做的这个课题：
这篇文章还是挺有意思的，他们研究的是胶质母细胞瘤，胶质母细胞瘤可以分成IDH（异柠檬酸脱氢酶）野生型或IDH突变两类。而浸润胶质母细胞瘤的巨噬细胞，又可以分成Mo-TAM（外周单核细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞）或Mg-TAM（脑驻留的小胶质细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞），其中Mo-TAMs浸润性神经胶质瘤通常会促进肿瘤增殖，而Mo-TAMs主要在IDH野生型的肿瘤细胞中和复发的肿瘤细胞中浸润增多。他们首先给不同的胶质母细胞瘤中浸润的TAM进行了单细胞测序（下图这种UMAP图大家应该都能看懂了吧，这个在《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》里也都讲过，其实就是通过测序进行不同的PCA分析，再将多主成因降维画出来这样的图，主要是给细胞进行分簇）：
结果发现的确野生型的胶质母细胞瘤中，浸润的Mo-TAMs增多，他们又给这些Mo-TAMs进行了细分，分成了六个表现出独特分子特征的簇：缺氧-TAM簇（表现出HIF1信号通路激活的下游转录靶基因，比如BNIP3和ADM，不熟悉HIF信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）、IFN-TAM簇（干扰素激活的下游表达增多作为标志的簇）、脂质-TAM簇（载脂蛋白表达增多作为标志的）、核糖体-TAM簇（核糖体相关基因表达作为标志物的），以及吞噬作用和抗原呈递 -TAM簇和趋化-TAM簇。通过对单细胞测序的具体分析他们发现，野生型胶质母细胞瘤中，Mo-TAMs的分簇与IDH突变型的也是不同的，野生型中缺氧-TAMs、趋化-TAMs、IFN-TAMs和脂质-TAMs的浸润增加：
接着他们分析了空间转录组，对于这几个Mo-TAM的分簇的具体浸润分布进行了分析，他们发现缺氧-TAMs优先局限于坏死周围区域，而IFN-TAM在血管周围区域的比例相对较高：
那么既然缺氧-TAMs会在坏死周围区域聚集，那么在胶质母细胞瘤中缺氧的具体情况是怎么样的呢？于是他们对人的胶质母细胞瘤切片上缺氧的梯度进行了具体的分析：
对缺氧-TAMs的空间特征进行分析后发现，缺氧肿瘤区域的缺氧-TAMs转录特征和ADM作为标记基因的表达明显上调，这也说明了缺氧-TAMs在胶质母细胞瘤的缺氧区域产生了富集：
那么大家应该知道TAMs的主要作用就是产生M2极化，导致免疫抑制，也就是通过M2极化阻断了对肿瘤的抑制作用。那么缺氧是否又是一个导致TAMs产生极化的原因呢？于是他们进行了Mo-TAMs的缺氧诱导极化分析，通过筛选他们找到了几个通过缺氧诱导的关键转录因子，也就是p50、HIF1α和JUN（分别是NFκB信号通路、HIF1信号通路以及MAPK信号通路上的，这几个都算是常见的信号通路了，比如p50+p65形成了NFκB，熟悉信号通路可以让你们读文献变得更快一些，不清楚的话可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列），这其中p50的确能调控ADM以及其他缺氧-TAMs中的靶基因表达。也就是说p50可以反式调控缺氧-TAMs中的转录：
为了确定p50是关键的反式作用因子，也就是转录因子，他们分析了缺氧后p50的入核（熟悉NFκB信号通路的话，应该知道，NFκB是会在IκB被泛素化降解后，入核启动转录的，这也就体现了NFκB的转录功能的启动，不熟悉的话，就回去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列）。结果发现，缺氧环境的确可以激活p50的入核，以及p50下游靶基因的转录：
在胶质母细胞瘤的坏死周围区域，富集的缺氧-TAMs，同时也伴随着丰富的微血管。那么是那个基因转录激活引发了血管的病变呢？于是他们对于缺氧-TAMs的标志物、HIF1信号通路下游基因以及分泌蛋白的数据库（因为血管形成可能是同细胞分泌的蛋白引起的）进行了交集分析，他们发现ADM是那个可能与调节脉管系统完整性密切相关的缺氧后转录激活的蛋白。于是他们进行了ADM的敲除（这也就是柯霍氏法则的验证，通过这个方法验证ADM与调节脉管系统完整性和发育的途径的关联，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），结果发现ADM的敲除，可以恢复小鼠胶质母细胞瘤的血管完整性。小鼠正常大脑的血管完整性和通透性不受ADM敲除的影响，而ADM的敲除也减少了胶质母细胞瘤的血管渗漏：
那么ADM是怎么样影响血管的完整性的呢？他们进一步分析发现，ADM敲除后，粘附连接通路的富集和编码基因CDH5的E-Cadherin表达增加（这个在细胞粘附信号通路里也都讲过，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列），也就是说有可能ADM可以破坏内皮粘附连接的稳定性，通过共定位及敲减分析，他们发现缺氧-TAMs分泌的ADM，激活了血管上皮细胞中的CRLR信号，从而破坏了E-Cadherin介导的粘附连接：
敲除了ADM会恢复血管完整性，那么过表达ADM呢？他们发现ADM的高表达，与胶质母细胞瘤中的肿瘤血管高通透性相关。而使用了AMA（ADM抑制剂）可以使得血管通透性正常化：
通过AMA与胶质母细胞瘤常用药物达拉非尼的联用，他们发现AMA可以改善达拉非尼的药物递送和治疗效果：
最后，形成了这样的示意图：
在胶质母细胞瘤中，缺氧的环境中，会使得浸润的Mo-TAMs通过缺氧，缺氧后诱导p50则能激活Mo-TAMs的M2极化。在缺氧环境中转录激活的ADM，则通过分泌，影响激活血管上皮细胞中的CRLR-E-Cadherin信号。激活后的CRLR使得E-Cadherin内化增加，也就是破坏了细胞间的E-Cadherin粘附，这就导致了血管的通透性增加。使用AMA抑制ADM，则能有效地防止血管的通透性增加，对于达拉非尼的疗效也有作用。这篇文章总的来说工作量是十分庞大的，难怪能发50.3分了，通过Mo-TAMs的分簇，发现了缺氧-TAMs，然后倒推到胶质母细胞瘤的缺氧环境，然后再发现缺氧后的ADM对于血管通透性的影响，这每一步其实都做得是比较紧凑的。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以去看看原文，祝你们心明眼亮。
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