增强CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗中疗效的新方法：靶向肿瘤微环境

背景

过继性免疫细胞治疗（ACT）是一种新型抗癌工具。已有证据显示，表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞具有显著的临床疗效，能够改善多数血液恶性肿瘤患者的结局。CAR是由细胞外结合结构域，跨膜区和细胞内信号/激活结构域组成的合成分子。细胞外成分由衍生自抗体单链可变区片段（scFv）的轻链和重链区组成，以独立于MHC的方式识别并结合特异性肿瘤相关抗原（TAA）。

铰链区通常衍生自CD8或IgG4分子，其用以连接细胞内和细胞外成分。最后一部分由触发T细胞激活的CD3ζ片段组成。第一代CAR载体仅有CD3ζ结构域。第二、三代除CD3ζ结构域外，各增加1-2个共刺激结构域（CD28和/或4-1BB）（图1）。所有这些成分通常使用γ-逆转录病毒或慢病毒转导系统插入。 

 图1. CAR结构。所有不同代的CAR均由胞外抗原结合结构域（通常衍生自抗体单链可变片段（scFv）），铰链区，跨膜结构域和各种细胞内结构域组成。第一代CAR，CD3ζ是唯一的信号结构域。第二代CAR增加了一个共刺激结构域，而第三代CAR包含CD28和4-1BB两次共刺激信号结构域。

众所周知，其他组织会发生LTR驱动转基因沉默，但是某项人淋巴细胞研究却未见载体沉默。有趣的是，一项研究表明，CAR T细胞的体内疗效，即CAR表达浓度的特性对抗肿瘤疗效以及全身和肿瘤部位CAR T细胞的持久性产生重大影响。

嵌合TCR分子在T细胞中的表达可以避开HLA限制，具有高特异性和强效激活能力，已成为最具前景的癌症治疗方法之一。然而，CAR T细胞在B细胞恶性实体肿瘤中产生的疗效却不尽如人意。阻碍CAR T细胞疗法应用于实体瘤治疗的问题有三：（1）肿瘤相关抗原的识别；（2）过继性转移细胞至肿瘤部位的运输受限；以及（3）肿瘤微环境的免疫抑制作用。本文将重点介绍第三个问题的解决方案（图2）。

图2. 靶向肿瘤微环境中的不同成分以提高CAR T细胞治疗的疗效。克服TME抑制作用的成果包括靶向免疫抑制群体（即PGE2），基质细胞，细胞因子网络以及免疫检查点信号策略

复杂多样的肿瘤微环境在肿瘤的发生发展和治疗耐受中发挥重要作用。最新研究强调了先天免疫激活对引导机体产生肿瘤相关抗原和抗肿瘤活性自发性T细胞免疫应答的重要性，Woo教授及其同事表示，胞浆DNA传感，I型IFN介导的STING通路激活是维持T细胞肿瘤炎症表型的主要参与者之一，而肿瘤炎症表型是免疫治疗反应的有利标志。

STING通路激活有助于Batf3依赖的树突状细胞活化，这可能是抗肿瘤免疫的核心。活化的树突细胞由趋化因子诱导至肿瘤部位，然后迁移至次级淋巴器官，并与CD8+T细胞相互作用。克隆扩增后，T细胞迁移回肿瘤微环境，并杀伤肿瘤细胞。

尽管尚未对先天免疫激活剂以及含CAR-T细胞的肿瘤炎性微环境进行彻底评估，但是从效应T细胞功能水平而言，抛开抗原呈递，肿瘤微环境对CAR-T细胞效应的调节作用应该是显著的。

此外，CAR T细胞在实体肿瘤瘤内膨胀性生长程度和持久性方面的临床疗效尚未确定。接下来，我们将探讨肿瘤微环境抑制免疫反应效应的各个方面，最新研发的一些改变肿瘤微环境，提高CAR T细胞治疗疗效的方法；其中某些方法可能有助于增强肿瘤对其他类型免疫治疗的敏感性。

实际上，尽管本文的重点是CAR T细胞，但是文中探讨的许多原理也适用于更广泛的过继性细胞疗法，如肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和TCR基因工程T细胞。

靶向缺氧，营养不足和代谢

缺氧和营养不足是肿瘤微环境的主要特征。营养缺乏，尤其是氨基酸，如色氨酸，能够激活调节T细胞活性的综合应激反应。吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）是一种细胞内酶，可以催化色氨酸降解为犬尿氨酸。肿瘤微环境内的肿瘤细胞和骨髓细胞均可以表达IDO，导致T细胞增殖和存活受阻。

近年来，Ninomiya教授及其同事证实，IDO表达也可以抑制CAR T细胞。特别地，他们表示，CD19 CAR T细胞无法控制CD19+ IDO表达的肿瘤进展。犬尿氨酸积累会抑制CAR T细胞扩增，细胞毒性和细胞因子的分泌，这表明IDO阳性耐药肿瘤可能存在这种机制。

有趣的是，他们表示，氟达拉滨和环磷酰胺可以减少IDO表达，进而改善CAR T细胞治疗功效。CAR T细胞联合IDO抑制剂用药可能是化疗和免疫治疗无效的恶性肿瘤患者的重要选择。

另外，肿瘤微环境的代谢应激可能能够调节T细胞代谢，分化和效应功能。事实上，肿瘤浸润淋巴细胞修饰自身代谢是对缺氧作出的反应，这也是实体瘤的特征。

而耐人寻味的是，共刺激结构域不同的CAR T细胞代谢途径不同，这反过来也说明了肿瘤微环境的可变持续性。

Kawalekar教授及其同事开展的研究表明，相较于携带有CD28信号结构域的CAR T细胞，4-1BB CAR T细胞提高了线粒体的生物合成，促进中央记忆表型CAR T细胞的生成，具有生存优势。相较之下，CD28-CAR T细胞可以产生效应记忆表型，增强糖酵解作用。

这项研究强调了工程T细胞在免疫抑制肿瘤微环境中存活和衰竭设计的意义。

改变肿瘤微环境中的代谢成分只是使CAR T细胞潜能最大化释放的一种可能性。Newick博士及其同事开展的关于抑制蛋白激酶A（PKA）的最新研究得出了相似结论。

PKA是肿瘤微环境中产生的另外两种免疫抑制因子：前列腺素E2（PGE2）和腺苷的下游效应子。不同的研究显示，以上两种免疫抑制因子能够有效抑制T细胞的增殖和活化。

研究人员通过正在表达的RIAD（调节I亚基锚定干扰物）肽干扰PKA对脂伐的锚定。RIAD肽能够取代PKA和ezrin蛋白的关系，与腺苷酸环化酶紧密结合，合成一种必需蛋白质。

相较于间皮素导向的CAR T细胞，间皮素导向的CAR-RIAD T细胞在体内表现出更高的浸润性，持久性和抗肿瘤活性。另外，RIAD表达导致趋化反应增强，受CXCR3表达的影响，具有更好的粘附性。随着这种方法转化为临床试验，RIAD肽的免疫原性可能成为一个问题。

另外一种可改变肿瘤微环境的方法是通过促进内源性免疫应答募集，增强CAR T细胞抗肿瘤反应。Curran教授及其同事已经通过CAR T细胞CD40L组成型表达验证了这一方法。

他们表示，该策略改善了CAR T细胞毒性，降低了PD-1表达，改善了CD40阳性滤泡淋巴瘤系统模型中DC抗原的呈递功能。这些机制可能与Gajewski博士及其同事所述的STING通路一致（如上）。

因此，靶向肿瘤免疫抑制群体，如PGE2和/或T细胞，改变肿瘤微环境的反应是提高免疫治疗功效的好机会。

靶向基质

靶向非恶性癌症相关的基质细胞（CASC）也可以增强抗肿瘤免疫治疗的功效。这些细胞可以分泌促进肿瘤生长，转移和血管生成的生长因子，细胞因子和趋化因子。其中最受关注的基质是成纤维细胞激活蛋白（FAP），这是一种参与90%以上上皮癌细胞外基质重塑，并由CASC选择性表达的丝氨酸蛋白酶。三个不同组的患者使用FAP CAR T细胞治疗后显示出明显差异。

Tran教授及其同事发表的文章表明，尽管由于体外抗原刺激，FAP CAR能够特异性脱颗粒，并产生效应细胞因子，但是它们并不能介导体内有效的抗肿瘤反应，甚至令人震惊的是，抗FAP CAR能够诱发严重恶病质和致命骨毒性。

作者发现FAP蛋白也由多能骨髓基质细胞（BMSC）表达，该表达与观察到的毒性有关。然而，Kakarla教授及其同事设计的人类肺癌小鼠模型显示，携带有不同scFv的FAP-CAR具有无毒性抗肿瘤功效。即使T细胞持久性受限，联合注射FAP特异性和肿瘤特异性T细胞也可以实现缓解。

Schuberth教授及其同事研发了一种适用于异种移植间皮瘤内FAP-CAR的过继性转移的腹膜内模型。他们掌握的数据显示生存率增加；然而，抗人FAP scFv与小鼠FAP没有发生交叉反应，这使脱靶效应的评估受到局限。

Wang教授及其同事发表的一篇论文表明，靶向FAP阳性细胞通过表位扩展增强抗肿瘤免疫。他们发现，免疫同系小鼠间皮瘤和肺癌模型抗FAP CAR治疗三天后，内源性CD4+T细胞活化，随后内源性CD69+，INFγ+CD8+ T细胞浸润数量增加。

免疫缺陷小鼠不发生抗肿瘤反应，这表明适应性免疫系统的重要性。此外，他们发表的另一篇文章表明，具有FAP抑制相关性的同一组模型也具有免疫独立抗肿瘤作用。Lo教授及其同事采用弱免疫原性和高度增生的肿瘤，胰腺导管腺癌开展的研究证实，FAP-CAR T细胞抑制了肿瘤的形成，降低了肿瘤血管密度，干扰了肿瘤细胞的空间取向。

关于可以识别高度阳性FAP细胞，并且携带有不同scFv的CAR T细胞的两项最新研究结果已经相当可靠，因此，Rosenberg教授等人在研究中发现的安全性问题可能与scFv的特异性和亲和力有关。

多模态靶向FAP具有抗肿瘤潜力，未来合理且有趣的免疫治疗方法组合包括抗基质CAR T细胞结合抗肿瘤CAR T细胞或检查点阻断治疗。

除靶向FAP外，运用CAR T细胞治疗基质丰富型肿瘤的另外一种最新策略是靶向乙酰肝素酶（HPSE）。HPSE负责硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HPG）的降解，这是T细胞向肿瘤部位运输和聚集的基本过程。

Caruana教授及其同事表示，加工过程中，CAR T细胞失去了HSPE表达，导致降解细胞外基质能力下降，影响CAR T细胞迁移。作者表示，异种移植神经母细胞瘤模型中，HSPE表达促进了肿瘤浸润，改善了存活率。

靶向细胞因子网络

塑造肿瘤微环境以提高ACT功效的另一种可能选择是诱导局部释放促进抗肿瘤免疫反应的刺激因子。在此前提下，白细胞介素-12（IL-12）和IL-18是具有前景的刺激因子。IL-12是一种炎性细胞因子，能够促进T细胞活化，诱导Th1 CD4 + T细胞应答，CD8 +克隆扩增，以及效应功能。

此外，它还能够将NK细胞募集至肿瘤部位，成为肿瘤相关巨噬细胞，重新激活无能的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），抑制调节性T细胞，并分泌IL-10, IL-4和β转化生长因子（TGFβ）。基于以上理论，几个研究小组研发了IL-12分泌与CAR表达相结合的“第四代”CAR T细胞。

Koneru教授及其同事[40]将所谓的“通用细胞因子杀伤重定向T细胞(TRUCK)”应用于正交异位卵巢肿瘤移植模型治疗。他们发现，(TRUCK)能够完全根除肿瘤，延长CAR T细胞的持久性，提高全身IFNγ水平。

为提高组成型，全身高水平IL-12的安全性，降低其不必要的毒性，Koneru教授及其同事研发了一种编码MUC-16ecto抗原特异性scFv，IL-12以及截断EGFR消除基因（EGFRt），并且可以局部施用的三顺反子表达载体。

相较于静脉给药，CAR T细胞腹腔给药疗效更显著。本文为确定此种方法安全性和可行性的，铂耐药卵巢癌患者I期临床试验奠定了基础。

CAR中，转基因有效负荷产生和释放时，应使毒性降至最低，另外，“关闭”系统，如EGFRt为安全性提供了额外的控制措施。

此外，IL-12表达对来自脐带血（UCB）的CAR T细胞的生成和功效非常重要。Pegram教授及其同事[43]引进了一种新型UCB T细胞扩增和遗传修饰技术。

首先，他们证实，向培养的活化UCB T细胞中加入IL-12和IL-15，可以使其150倍扩增，并具有记忆性和效应标志物理想表型。

其次，抗CD19 CAR载体中IL-12表达能够在不需要预处理或Il-2辅助的情况下，显著提高急性淋巴细胞白血病（ALL）小鼠的存活率。

这些数据支持运用ACT，进一步增强高危，复发/难治性ALL UCB移植患者移植物抗白血病效应的临床转化。

另外一种调节肿瘤微环境信号的可行性策略是直接抑制TGFβ，IL-10，和/或IL-4信号。众所周知，肿瘤细胞和肿瘤相关细胞分泌第一个分子是肿瘤免疫逃逸的一个机制，而IL-10和IL-4是有效的免疫抑制细胞因子。

基于此的一种方法是强制T细胞表面过表达显性负性受体。张教授及其同事在黑色素肿瘤模型中发现，TGFβ DNRII过表达的T细胞在体内和体外的抗肿瘤功效增强。尽管已经取得了前瞻性的结果，但是我们必须进行进一步研究以验证CAR T细胞治疗背景下这一方法的有效性。最近，Mohammed教授及其同事研发了一种用于以IL-4水平升高为特征的前列腺癌治疗系统。

这种系统由反转细胞因子受体（ICR）组成。具体而言，该4/7ICR由与IL-7细胞内免疫刺激结构域结合的抑制性IL-4受体细胞外结构域组成。第一代抗PSCA CAR载体和ICR共表达导致体外和体内抗肿瘤活性增加。

这种方法将T细胞信号转化为刺激性信号，同时剥夺了癌细胞的重要生长因子。第二代CAR与4/7 ICR组合可以改善这些结果。

靶向免疫检查点

肿瘤微环境发挥免疫抑制作用的主要机制是诱导表面抑制性受体，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和程序性死亡-1（PD-1）上调。抗原-受体结合后，这些分子会自然上调以抑制组织内T细胞活化，维持外周耐受。

更好地了解肿瘤微环境各种内在抑制通路的活化机制可以成功进行免疫检查点治疗。此外，最新研究揭示，PD-1在人类细胞衰竭过程中起着关键作用。John教授及其同事[47]发表了首个“CAR T细胞表达PD-1，并易受PD-A介导的抑制”概念验证研究。

作者表示，采用CAR T细胞和抗PD-1抗体治疗Her2+荷瘤小鼠时，其抗肿瘤活性改善。奇怪的是，肿瘤明显消退时，肿瘤微环境中髓源性抑制性细胞（MDSC）却在减少。然而，抗肿瘤活性增加机制及MDSC的调节作用仍有待证实。

Moon教授及其同事后续开展的一项研究证实，间皮瘤模型中，CAR TILs表面PD-1表达增加与其功能缺失有关。通过阻断PD-1，恢复了体外间皮瘤CAR T细胞的细胞毒性。除了施用免疫检查点抗体外，阻断免疫检查点的另一种方法是采用基因工程策略。

例如，刘教授及其同事将PD1：CD28开关受体插入CAR载体。该受体由Prosser等人研发，旨在表达融合CD28跨膜区和信号结构域的PD-1细胞外结构域；该构建体与内源性PD-1竞争，发挥显性阴性模型的作用，和/或与PD-1结合后，通过细胞质结构域主动发出信号。作者分析了静脉滴注PD1:CD28 CAR T细胞在大型，已确定的实体肿瘤，如异种移植模型中的间皮瘤和前列腺癌治疗中的功效。

他们表示，肿瘤和外周血中CAR TILs分泌频数显著增加，离体抗肿瘤功能更大，分泌更多细胞因子。有趣的是，运用具有突变信号结构域的开关受体可以消除这些结果，这说明CD28共刺激结构域在融合构建体中发挥主要作用。

相反，Cherkassky教授等人证实，间皮瘤异种移植模型中，CAR T细胞与PD-1的“显性阴性”表达结合具有更强的持久性，可以增强抗肿瘤作用，延长存活率。该模型中PD-1“显性阴性”形式仅由PD-1细胞外结构域（无信号结构域）组成，其可能与内源性PD-1竞争结合PD-L1。产生以上结果的一个可能原因是经治疗肿瘤的类型不同。

另外，Cherkassky教授及其同事表示，相较于包含CD28信号区域的CAR T细胞，较低剂量具有4-IBB共刺激结构域的CAR T细胞即可发挥功效，并且其抗PD-1介导的细胞衰竭能力更强。

其他肿瘤模型也表明，PD-1介导的CAR T细胞抑制是一种普遍的抑制机制，尤其是具有免疫活性的小鼠模型。了解嵌入CAR的共刺激结构域的作用及其介导抗抑制分子和抗CAR T细胞衰竭的不同机制也很重要。

尽管尚未确定最具安全性和有效性的检查点组合，但是这些临床前数据证明，免疫检查点阻断与CAR T细胞结合是改善CAR T细胞治疗患者临床结局的合理治疗策略。

总结

运用CAR T细胞进行过继细胞治疗能够有效治疗某些B细胞恶性肿瘤。最近出现了很多关于采用TIL疗法靶向治疗突变型KRAS转移性结直肠癌以及靶向IL13Rα2的CAR T疗法治疗多形性胶质母细胞瘤的刊物，但是实体瘤治疗结果仍可能受到各种限制，如免疫抑制性肿瘤微环境。

事实上，微环境不仅形成了阻碍修饰T细胞渗入肿瘤肿块的物理屏障，还通过上调抑制信号发挥免疫抑制作用。目前已经研发出了创新型策略来克服这些挑战（图2），如CAR T细胞结合检查点阻断用药，以及与靶向肿瘤基质和免疫抑制分子的其它药物，治疗方案以及CAR T细胞联合用药。

这些策略中，多数已经经过异种移植和同系小鼠模型检测，我们迫切期待开展有关这些组合的临床试验。基于对特殊肿瘤特征以及免疫细胞与肿瘤环境之间相互作用的深入了解，临床前试验将确定这些方法的合理组合。

为确定实体瘤患者最安全和最有效的治疗组合，我们可能需要迭代临床试验来转化最佳组合。