UMI-tools 唯一分子标识符（Unique Molecular Identifiers ，简称UMIs） 是一种用于识别和区分单个分子的技术，有助于在测序过程中区分真实的生物分子和由 PCR 扩增引起的重复分子。umitools 是一个用于分析含有唯一分子标识符（UMIs）的高通量测序数据的生物信息学工具，它通过提取、校正、去重和计数等功能，帮助研究者准确分析单细胞 RNA 测序数据，从而揭示细胞异质性和基因表达模式。
GitHub：https://github.com/CGATOxford/UMI-tools 官方文档：https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/ 发表文章 题目 ：UMI-tools: Modelling sequencing errors in Unique Molecular Identifiers to improve quantification accuracy 期刊 ：Genome Research日期 ：2017年1月作者&单位 ：Tom Sean Smith && 剑桥大学DOI ：http://genome.cshlp.org/lookup/doi/10.1101/gr.209601.116
如何安装 由于依赖项过多，官方都不建议源码安装，所以我们还是采用conda安装，简单省事。
conda activate scRNA#测试 cond安装 成功 功能简述 子命令 通常的步骤是：
最小化使用 测试数据 wget https://github.com/CGATOxford/UMI-tools/releases/download/v0.2.3/example.fastq.gz 如果服务器直接下载不下来，可以使用本地电脑下载后，上传到服务器
extract — 提取UMI UMI 是连接到起始读数的随机核苷酸。在映射读数之前，必须从读数中删除随机核苷酸，同时保留序列。这时候就可以使用 extract 实现。但是几种使用唯一分子标识符（UMIs）的技术都是将 UMI 序列与文库条形码混合在一起。在这种情况下，我们希望去除条形码的随机部分，但保留文库部分，以便对读取进行多路复用（de-multiplexed ）。此时可以通过指定 --bc-pattern 参数实现。
使用 extract 的时候有两种方法可以指定 cell barcode和UMI的位置：
基于字符串的模式： Ns 表示条码的随机部分(UMI)，C s 表示 cell barcode 部分，Xs 表示固定部分，应在读取时保留。此模式默认应用于5‘端reads。如果是3’端，则需要添加 --3-prime 参数。
例如，在标准 iCLIP 实验中，条形码由 3 个随机碱基组成，后跟一个 4 个碱基文库条形码，然后是另外 2 个随机碱基。因此，它将是“NNNXXXXNN”。
提取UMI示例 umi_tools extract --stdin=example.fastq.gz --bc-pattern=NNNNNNNNN --log=processed.log --stdout processed.fastq.gz提取前后对比 对于双端测序 umi_tools extract -I pair.1.fastq.gz --bc-pattern=NNNXXXXNN \ 正则表达式模式 通过 --extract-method=regex 参数设置为正则表达式模式。正则表达式提供了一种更灵活的方法来提取读取中 UMI +/- 细胞条形码。
与基于简单的字符串相比，正则表达式具有许多优势：
与正则表达式不匹配的读取将被丢弃。例如，这可用于过滤不包含适配器序列的 reads。 可以对可变的 cell barcode 长度进行编码。 正则表达式允许在适配器等中进行模糊匹配（错误感知）。 正则表达式必须包含命名捕获组，以定义条形码在读取中的编码方式。命名捕获组是 python 正则表达式方言中提供的非标准正则表达式功能。捕获组是用括号括起来的模式的子部分。与子模式的匹配项将被“捕获”，并且可以提取以供重用。因此，模式 (.{4})TTTTT 将匹配任意 4 个字符，后跟 5 个 T，并返回这 4 个字符。在大多数情况下，我们通过其位置（第 1 组、第 2 组等）来引用捕获组。命名捕获组允许使用 (?P 语法。因此，(?P.{4})TTTTT 匹配与上述模式相同，但捕获的组被命名为 “prefix”。
regex 中允许的 groups 为：
umi_n = UMI 位置，其中 n 可以是任何值（必需）cell_n = 单元格条形码位置，其中 n 可以是任何值（可选）discard_n = 要丢弃的位置，其中 n 可以是任何值（可选）例如：一个 FASTQ 文件，其中 5' 端有一个 4 个碱基 UMI，3' 端有一个 4 个碱基 UMI。要提取这些 UMI，我们可以使用正则表达式：
^(?P.{4}).+(?P.{4})$ ^(?P.{4}) 匹配读取开始时的 4 个碱基，并将其提取为名为 .+ 匹配前 4 个碱基和后 4 个碱基之间的所有碱基（+ 表示必须至少有一个）(?P.{4})$ 匹配读取末尾的 4 个碱基，并将其提取为名为 umi_tools extract -I test_fq --extract-method=regex --bc-pattern='^(?P.{4}).+(?P.{4})$' -S test_processed_.fq -L test.log 正则提取前后对比 dedup — 去重 dedup 支持通过多种方案对 UMI 进行重复数据删除。
通过生成读组推断来自单个独特分子的重复读数，以频率最高的 UMI 为代表。不同方法有不同的分组方式。
简单方法的去重方式 ：unique 和 percentile 方法将完全相同的 UMI 的读数分组。基于网络方法的构建 ：cluster、adjacency 和 directional 是基于网络的方法，节点为 UMI ，边以编辑距离小于或等于阈值（通常为 1）连接 UMI，构建网络。以特定的方法的方式从网络中定义读取组。从UMI序列估计独特分子的方法 从UMI序列估计独特分子的方法，并在单个位点计数。如果该方法使用UMI计数，则显示这些。红色碱基被推断为测序错误，蓝色碱基被推断为PCR错误。括号中显示了每种方法的独特分子的推断数量。
# #bam文件创建索引 # #去除重复 # #双端数据 注：bam文件需要先构建索引
更多用法示例见：https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/Single_cell_tutorial.html
