循环肿瘤DNA（ctDNA）检测是一种基于血液的液体活检技术，用于检测和分析肿瘤释放到血液循环中的DNA片段。这项技术在癌症的早期诊断、治疗监测和复发检测中具有重要应用。目前，在手术前对早期患者进行肿瘤源- ctDNA检测受到限制，主要是因为组织获取受限和转诊时间长。小编为大家带来一篇关于早期肺癌术前ctDNA检测的文章，研究旨在评估tumor-naive（无肿瘤组织依赖）、基于甲基化的游离DNA检测在非小细胞肺癌（NSCLC）手术患者中的临床价值，分析了大样本NSCLC患者的术前血浆样本，评估ctDNA状态与肿瘤体积、代谢活性、组织学、组织学亚型和临床至病理TNM分期升期的预后意义。
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一、研究背景
在治疗干预前的诊断中检测的ctDNA，正在成为包括 NSCLC 在内的多种早期实体肿瘤的不良预后生物标志物。这一结果在肺腺癌（LUAD）中尤为明显，ctDNA 阴性与手术后的良好预后有关。鉴于以 ctDNA 为基础的多癌血液检测的出现和普及，它既是癌症的早期检测方法，也是有症状患者加速诊断的途径，医生在临床诊断时可能越来越倾向于借鉴患者的 ctDNA 检测状况。因此，干预前 ctDNA 检测的预后结果可能会作为风险指标纳入临床指南，有可能成为补充 TNM 分期的血液参数。
ctDNA 检测采用新一代测序和数字聚合酶链反应等先进技术，这些检测有两个主要目的：评估根治性治疗后的微小残留病灶和监测系统治疗期间的治疗效果。微小残留灶检测可检测治疗后低水平的ctDNA，以确定早期复发，通过利用患者肿瘤的特定突变提供高灵敏度检测结果，但由于肿瘤组织有限，在早期阶段可能具有挑战性。相反，tumor-naive ctDNA检测不需要事先获得肿瘤信息，而且周转时间快，因此可用于术前风险分层。tumor-naive ctDNA检测的一大进步是使用了肿瘤特异性甲基化模式，但其在早期NSCLC患者中的临床应用还有待广泛评估。
本研究分析了 895 例EGFR和ALK野生型 NSCLC 患者的治疗前 ctDNA 样本，这些患者可能是围手术期从细胞毒性或免疫检查点抑制剂治疗中受益的人群。使用一种基于血液甲基化的 ctDNA 检测方法来评估干预前 ctDNA 检测对预后的影响，这种检测方法不需要通过肿瘤组织测序来确定 ctDNA 状态，同时确定手术前 ctDNA 状态与早期 NSCLC 中已知预后因素的关联。
二、主要结果
1. 通过靶向甲基化分析检测ctDNA
从前瞻性收集的生物库中选取了2014年3月至2020年12月期间接受手术的临床I期至II期EGFR/ALK野生型NSCLC患者，对这些患者的术前血浆样本进行了tumor-naive靶向的游离DNA（cfDNA）甲基化检测分析。靶向 cfDNA 甲基化检测利用固定的 ctDNA 阳性阈值，该阈值为在循环游离基因组图谱研究（NCT02889978）的健康参与者中验证的 97% 临床特异性，并且是根据先前在早期（I 期）NSCLC 预后对照队列中的最佳预后表现而选择的。
2. 早期 NSCLC tumor-naive术前 ctDNA 检测
在接受 cfDNA 分析的 895 例患者中，188例临床 I 期和209 例临床 II 期 NSCLC 患者的术前血浆样本中可检测到超过预设阈值的ctDNA（图1A、B）。ctDNA的检测结果因NSCLC组织学亚型而异，121例（22%）LUAD患者显示ctDNA阳性，228例（81%）肺鳞癌患者显示ctDNA阳性，48例（81%）其他NSCLC组织学亚型患者显示ctDNA阳性。在LUADs与non-LUADs分组比较中，临床 II 期患者比 I 期患者更有可能在手术前检测到 ctDNA。
图1 与术前ctDNA分析相关的临床特征
研究采用的靶向甲基化方法可对ctDNA阳性病例进行癌症信号源（CSO）预测，从而根据异常甲基化模式推断出ctDNA的可能来源，对397 例（44%）手术前 ctDNA 阳性患者进行了 CSO 预测评估（图 1 A、B）。在手术前 ctDNA 阳性的 LUAD 患者中，87 例（72%）被确认为是肺部CSO，其次7 例（6%）报告了前列腺 CSO（图 1 C）。在术前 ctDNA 阳性的肺鳞癌患者中，有 195 例（86%）报告为肺 CSO，20 例（9%）报告为头颈部 CSO（图 1 C）。共有48例手术前ctDNA结果呈阳性的患者被诊断为其他NSCLC组织学亚型，包括腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌、分化不良NSCLC和多形性癌。在这组患者中，30例（62%）报告了肺CSO，14例（29%）报告了肺神经内分泌CSO。在确定为肺神经内分泌 CSO的患者中，9 人（64%）的肿瘤组织学报告有神经内分泌成分，其余 5 人分别是未另作说明的 NSCLC（3 人）、大细胞未分化癌（1 人）和分化不良的 NSCLC（1 人）。
3. 肿瘤体积和 PET 阳性与 ctDNA 检测相关性
肿瘤体积已被证明与 NSCLC 手术前 ctDNA 检测相关，研究分析了手术前 CT的肿瘤体积数据。手术前 ctDNA 阳性 NSCLC 的肿瘤体积高于 ctDNA 阴性 NSCLC（图 2 A）。在肿瘤体积小于 5 cm3的患者中，15 例（8%）LUAD 患者 ctDNA 阳性，27 例（44%）非 LUAD 患者ctDNA 阳性；在肿瘤体积大于 5 cm3的患者中，大多数非 LUAD 患者ctDNA 阳性。然而，LUAD 患者的ctDNA 检出率仍然很低（图 1 A、B）。
图2 肿瘤体积和 PET 阳性与术前ctDNA 检测
肿瘤内 PET-CT 参数的最大 SUV（SUVmax）也与 NSCLC 的 ctDNA 检测有关。手术前 ctDNA 阳性与 LUAD和非 LUAD的较高 SUVmax 值有关（图 2 B）。多变量逻辑回归分析显示，肿瘤体积、PET SUVmax 和肿瘤组织学亚型（LUAD 与非 LUAD）是术前检测到 ctDNA 的独立预测因素。
在不同的肿瘤体积和 PET SUVmax 范围内，PET SUVmax 和肿瘤体积与 ctDNA 阳性之间存在相互作用。在 LUAD 患者中，PET 阳性率和肿瘤体积作为 ctDNA 阳性的预测因子存在非线性关联，在肿瘤负荷较低时，ctDNA 检测的前提条件是存在氟脱氧葡萄糖阳性率（图 2 C）。在非 LUAD NSCLC 患者中，ctDNA 检测对氟脱氧葡萄糖嗜性的要求并不明显（图 2 D）。这些分析表明，肿瘤负荷和新陈代谢活动都是在 NSCLC 中使用tumor-naive靶向甲基化方法进行术前 ctDNA 检测的先决条件。
4. 术前ctDNA检测与病理分期升期
先前研究发现，早期NSCLC患者术前ctDNA检测与病理分期升期风险升高有关。研究将临床诊断为 I 期或 II 期 NSCLC 的患者随后分别诊断为病理 II 期至 IV 期或 III 期至 IV 期定义为升期（图 1 A 和 B）。分别分析了LUAD 和非 LUAD患者手术前 ctDNA 检测与疾病升期的相关性，在临床 I 期 LUAD和非 LUAD患者中，临床到病理分期与术前 ctDNA 状态之间存在关联，在临床 II 期 NSCLC 中，无论组织学诊断如何，均未观察到关联。在临床 I 期 LUAD 中，手术前 ctDNA 检测可用于强调升期风险的增加；在临床 I 期非 LUAD 患者中，如果术前未检测到 ctDNA，则升期的风险会降低（表 1）。
表1 ctDNA阳性与升期风险的关系
5. 手术前ctDNA检测与临床结果
对于LUAD患者，ctDNA在临床I期疾病中具有预后作用。55/414（13%）ctDNA阳性临床I期LUAD患者的无复发生存率（RFS）低于ctDNA阴性患者（图3A），ctDNA阳性临床I期患者的RFS与临床II期患者的RFS相当。在临床II期疾病患者中，66/140（47%）患者中检测到手术前ctDNA，其2年RFS率为70%，与临床I期疾病的结果相反，ctDNA阴性患者的结局不佳（图3B）。这表明需要进一步优化II期LUAD预后的ctDNA检测阈值，以便进行风险分层。在总生存率（OS）分析中观察到类似的结果（图3C、D）。与之前的结果一致，在临床I期或II期非LUAD组织学的
患者中，未观察到手术前ctDNA检测与RFS或OS之间存在关联。
图3 临床 I 期- II 期 LUAD 术前 ctDNA 与临床结果的关系
6. ctDNA状态将实性成分比（CTR）定义为风险参数
CTR是指在手术前CT中肿瘤结节的实性成分比例，是预测临床I期LUAD病理侵袭性的潜在参数，已被纳入日本临床肿瘤学小组进行的几项干预性试验设计中，以指导手术切除的范围。研究确定了I期LUAD患者的CTR与术前ctDNA检测之间的关联，ctDNA检测在临床I期LUAD肿瘤的实性亚群（CTR = 1）中富集（图1A）。ctDNA阳性状态出现在IA2 - IB LUAD的实性亚群中（图4A）。通过将I期LUAD队列分为3个亚组，评估了成像上的实性成分与手术前ctDNA状态关联：实性结节且ctDNA阳性，实性结节且ctDNA阴性，以及非实性结节（无论ctDNA状态如何）。与实性结节且术前ctDNA阴性的患者或非实性结节的患者相比，CTR = 1（实性）结节且术前ctDNA阳性的患者的RFS和OS较差（图4B、C）。这些数据支持将术前ctDNA状态与CT 实性成分评估相结合，以识别更有可能出现不良结局的I期临床患者。
图4 术前 ctDNA 状态与CT确定的CTR的整合
7. 术前ctDNA状态可预测国际肺癌研究协会（IASLC）LUAD组织学分级
接下来，研究试图确定术前的ctDNA状态是否与切除的侵袭性LUAD标本中确定的组织学分级相关，评估了对 LUAD 的预后有重要影响的 IASLC 分级标准。观察到队列中病理I期LUAD患者的IASLC组织学分级与RFS显着相关，但与OS无关，术前ctDNA在最终诊断为3级LUAD的临床I期患者中富集。在345名可获取组织学分级的临床I期LUAD患者中，术前ctDNA检测对切除标本中组织学分级为3级的阳性预测率为72%，阴性预测率为80%。因此，ctDNA可用作LUAD组织学分级（术后确定）的术前替代检测方法。
8. 术前ctDNA阳性患者和PD-L1状态
实性亚型（高级别）LUAD的组织学诊断、增殖率和不良结局与LUAD中PD-L1水平升高有关。鉴于临床I期LUAD的术前ctDNA检测与相似的特征相关，研究试图确定术前ctDNA阳性的患者是否具有独特的PD-L1分布。根据PD-L1阳性率对临床I期和II期LUAD进行了分类：<1%、1-49%和≥ 50%。观察到在临床 I 期术前ctDNA 阳性 LUAD 患者中，PD-L1 1%或更高状态的可能性增加（图 1 A，图 5），在临床 II 期 LUAD 中也观察到了类似的情况。
图5 术前ctDNA状态与切除的LUAD标本中的PD-L1表达水平有关
三、讨论与总结
总之，研究在EGFR/ALK 野生型 I 期-II 期 NSCLC 患者中探讨了术前 ctDNA 检测的临床意义，验证了术前 ctDNA 检测对临床 I 期 LUAD 患者具有预后价值。首次报告了术前 ctDNA在区分I期而非II期疾病风险方面的临床实用性。此外，tumor-naive方法也为高危的 LUAD 患者在手术前采用 ctDNA- 适应性治疗升级策略（如新辅助免疫检查点抑制剂疗法）提供了理论依据。
研究采用了一种无需肿瘤组织信息的ctDNA检测方法，探索了术前ctDNA与各种临床因素之间的关系，及其对预后的指导意义，体现了其在临床实践中的实用性，并为未来后续的研究提供基础、研究思路。
参考文献：
Hong TH, Hwang S, Dasgupta A, Abbosh C, Hung T, Bredno J et al. Clinical Utility of Tumor-Naïve Presurgical Circulating Tumor DNA Detection in Early-Stage NSCLC. Journal of Thoracic Oncology 2024.
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