产品质量与工艺

1.介绍

产品质量是生产治疗用产品最重要的方面之一，对于生物制剂来说更是如此。这些产品的复杂结构使得质量决定因素更难量化。确保生产过程能够生产出一致质量的生物制剂对制造商和公众都至关重要。生产过程应该设计得能够稳健地提供一致的产量和产品质量。目前，细胞和病毒作为治疗剂的使用日益增加，它们的复杂程度甚至超过了蛋白质。尽管基因和细胞治疗产品仍然不多，但维持和监控这些产品的质量将变得更加重要。治疗性蛋白质生产的巨大知识和经验将有助于为这些新产品的生产过程发展铺平道路。

什么构成了产品质量？一般来说，一个产品的结构身份（ 图版 4.1）确定了它。有时，在生产过程中会产生产品的结构变体。这些必须在药物物质中得到控制，以限制它们的含量在可接受的限度内。大多数治疗性蛋白质是糖蛋白，其糖链在各个蛋白质分子之间略有不同，但其糖链的异质性必须在一定的范围内。不可避免地，产品会有一些污染物，这些污染物的含量也必须在设定的限度内。最后，在产品发布之前，产品必须经过测试并证明在生物学上是功能性和安全的。一般的质量要求和表征方法详细列在表4.1中。

细胞培养生物过程的生产力目前非常高。对于许多蛋白质，如IgG，反应器中的滴度已经超过了其在体内原始环境中的最高水平。在如此高的浓度下，与其他组分的物理相互作用可能与老一代工艺或体内的情况不同。这些分子相互作用可能会对蛋白质聚集或宿主细胞蛋白污染带来挑战。如今实现的高生产力是通过高细胞浓度和通常的高应激培养条件实现的，例如高糖含量、高盐和废物代谢物浓度以及生产生物反应器中的低温。在更极端的培养条件下，分泌的产品可能会受到化学修饰以及由死亡细胞释放的酶引起的酶促修饰。一些高阶蛋白质结构变化，如聚集或断裂，甚至可能在产品回收过程中发生。对于一些产品，生产细胞系的生产力已经达到甚至超过了人体中专业分泌细胞（例如，肝细胞和抗体及胰岛素分泌细胞）的分泌速率。目前尚不清楚这些高产细胞，已经被推到了与蛋白质合成和分泌相关的某些功能极限，是否使它们的产品面临更高的概率偏差（例如，糖链轮廓中更高程度的异质性或更高的氨基酸错配率）。

确保生产过程中一致产品质量的首要任务是确定对产品安全性和临床效果起关键作用的产品属性。这是在产品开发过程中进行的，知识在开发过程中得到应用。在生产过程中，产品在生物反应器中生产，通过下游步骤纯化，作为药物物质储存，然后转化为用于临床应用的药物产品。然后应识别可能导致产品质量不满意的生产和下游回收的运行条件，并定义关键过程参数的控制范围。产品上市后，产品质量数据不断收集、汇编和分析，以更好地控制生产过程中的产品质量。质量提升和工艺改进的过程在产品的整个生命周期中持续进行。

本章将首先讨论蛋白质生物制剂的化学和物理属性，这些属性是重要的质量属性。其次是关于质量源于设计（QbD）的讨论，这是一种工艺开发方法，通过主动设计生产过程和控制来实现预期的产品。最后一节强调了在整个产品生命周期中保持一致产品质量的重要性。

2.蛋白质产品的质量

2.1.蛋白质产品的身份

在通过重组细胞进行蛋白质生产时，产品基因的身份由编码产品的基因序列和下游纯化过程决定。在产品开发的早期阶段，产品的化学结构身份在基因序列水平和蛋白质水平上都得到了确认。在生产过程中，产品通常进行测试，以确保其结构完整性，并检测结构变体的存在。

分子和免疫化学身份及定量

蛋白质产品的身份通常由其分子量和化学结构确定。纯化的蛋白质通常在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上运行，以评估其分子量和纯度，即是否受到其他蛋白质的污染。在电场中，纯化的蛋白质溶液在聚丙烯酰胺凝胶上运行，根据其大小或分子量（图4.1）分离单个蛋白质。电泳后的凝胶用Coomassie Blue或银染染色，以可视化蛋白质从其初始位置的迁移。通常，加载到PAGE的蛋白质样品用十二烷基硫酸钠处理，该物质使蛋白质变性，解离非化学交联的蛋白质亚基，并延伸蛋白质以更好地反映其大小。由于较大的蛋白质迁移速度较慢，因此可以通过校准到蛋白质标记物混合物来确定蛋白质分子的分子量。PAGE还用作检查蛋白质纯度的工具。一个高度纯化的蛋白质产品应该只显示产品的凝胶带，没有任何污染带。一些蛋白质由通过二硫键结合在一起的亚基蛋白质组成（例如，IgG）。在天然（未变性）蛋白质凝胶和还原凝胶（其中还原化学品破坏二硫键）上，蛋白质因此显示出不同的带，因为还原的单体以不同的速率沿着凝胶向下迁移。这种类型的分析通常用于检测由酶促降解产生的低分子量物种或片段。

图 4.1. (a) 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于确定产品蛋白的分子量和纯度。(b) 酶联免疫吸附测定(ELISA)用于确定抗原浓度。

西方印迹是另一种用于识别产品蛋白质的方法。在纯化的产品蛋白质在PAGE上运行后，蛋白质被转移到膜上。然后该膜用针对产品蛋白质的抗体处理。该抗体以前用酶、同位素或荧光标记物标记，与蛋白质带结合。

当膜上的未结合抗体被洗去，并且应用了抗体偶联酶的显色底物时，产物蛋白带出现在正确的分子量位置。利用针对产物蛋白的抗体的免疫学方法酶联免疫吸附试验（ELISA）被广泛用于测量蛋白浓度。ELISA有多种实施方式。在一种情况下，针对产物蛋白的抗体被包被在96孔或384孔的酶标板上（图4.1b）。然后加入含有不同稀释度产物的样品溶液以允许与抗体结合。接着加入第二种识别产物不同表位并且已经与酶偶联的抗体，以结合被板涂层上的抗体捕获的产物。经过洗涤步骤后，通过测量酶反应的速率来定量测定第二抗体上的酶在包被表面上的剩余量。常用的酶通常将显色底物转化为具有可见信号的产物。例如，辣根过氧化物酶（HRP）将底物转化为可以利用分光光度计检测的有色分子。使用一系列稀释的纯化抗原构建的标准曲线用于确定样品中抗原的浓度。这种“夹心ELISA”用于定量测定抗体产品和其他许多蛋白。另一种特定于抗体定量的方法是利用亲和色谱法。优先与抗体结合的蛋白质A被固定在柱支撑上。在中性pH下，抗体分子通过Fc区域与蛋白质A结合，而宿主细胞蛋白、细胞培养基成分和缓冲液流经柱子。在酸性pH下洗脱捕获的抗体，并通过在280纳米处的紫外吸收来检测。使用标准曲线和相应的峰面积通过线性回归分析得出。样品和对照产品浓度从校准曲线计算得出。

肽序列一致性

基于一级结构，或蛋白质的氨基酸序列，是对蛋白质身份最准确的检查。这通常是通过使用自动蛋白质测序仪的经典的Edman降解法或液相色谱后接质谱法来完成的。在Edman降解中，具有多条链的复杂蛋白被分离成单链分子。然后大蛋白被酶消化成少于50个氨基酸长的片段。接下来，目标蛋白或肽被固定在固体上，并从蛋白的N端进行化学水解。释放的氨基酸被荧光标记并在高效液相色谱（HPLC）中被识别。通过循环终端氨基酸降解过程，可以建立整个蛋白的序列。

氨基酸序列一致性也可以通过质谱法建立。为了建立蛋白产物的序列一致性，纯化的蛋白被蛋白质水解酶（通常使用胰蛋白酶来切割位于赖氨酸或精氨酸旁边的肽键的C侧）切割成更小尺寸的肽（ 图版 4.2）。这个过程将蛋白切割成大部分由15-30个氨基酸长的肽片段（ 图4.2 ）。然后将得到的肽混合物进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）或毛细管电泳进行分离。接下来，肽被分离成峰，并输入到质谱仪（MS）中进行检测。每个肽峰将具有与参考标准相比的相应胰蛋白酶肽的特征质量/电荷比（m/z）。通过使用串联质谱（MS/MS）进一步将每个肽切割成一系列肽片段离子。由于每次断裂事件都会断裂一个肽键并生成两个片段，一个在N侧（y离子）和一个在C侧（b离子），这些y和b离子具有特征性的m/z值，对应于相应肽的断裂模式。从这个模式中，可以推断出氨基酸序列（图4.3）。因此，质谱法可用于去新序列测定，即在未知蛋白质身份的情况下。

图 4.2. 利用质谱在胰蛋白酶消化后确定已知序列的蛋白质的身份。

图 4.3. 在MS/MS中胰蛋白酶肽段的碎片化，产生连续的b-和y-离子序列，用于de novo序列测定。

质谱法也用于序列验证。通过搜索蛋白质数据库以匹配断裂模式，基于质谱的方法可以很容易地用于找到蛋白质的身份，甚至在混合物中识别蛋白质。它也是一种敏感的蛋白质身份验证方法。如果肽中的氨基酸发生改变或在一小部分蛋白分子中发生化学修饰，质谱中的断裂模式将与原始的不同。质谱法也可用于检测纯化蛋白样品中的污染蛋白。因此，它是蛋白识别以及化学结构变体检测中的重要工具。

高阶结构一致性

蛋白质的生物学功能和活性由其高阶（二级、三级和四级）结构决定。即使其氨基酸序列未改变，蛋白质分子可能具有改变的二级、三级或四级结构。相反，氨基酸变化对蛋白质功能活性的影响取决于氨基酸变化的位置及其对蛋白质高阶结构的影响。高阶结构的变化可能导致不同的生物活性甚至免疫原性（ 图版 4.3）。在生物类似蛋白治疗药物的比较研究中，重要的是要证明生物类似的高阶结构与创新药物相同。用于确定蛋白质高阶结构的传统分析工具包括X射线衍射和核磁共振（NMR）。由于需要的材料量和分析所需的时间较长，这些方法在常规表征中的使用受到限制。

在远紫外区域的圆二色光谱法用于揭示蛋白质二级结构的变化。由于蛋白质的手性本质，它们对左手和右手圆偏振光的吸收不同。在圆二色光谱法中，蛋白质的吸收光谱不仅受到其α-螺旋和β-片层含量的影响，还受到其三维结构的影响。因此，这种研究是揭示蛋白质在暴露于变化剂时二级结构变化的强大工具。

2.2. 杂质

在成为制剂填充的药物物质之前，细胞培养中生产的治疗蛋白会经过广泛的纯化、病毒灭活和病毒颗粒清除。然而，纯化的蛋白中不可避免地存在杂质（面板4.4）。这些杂质可能来自培养基成分，或来自宿主细胞释放的分子或溶解的宿主细胞。杂质可能是与产物蛋白共纯化的化合物，或者在各种产物纯化操作中与产物区分不够。它们也可能因为与蛋白质的物理结合而产生。表征和定量这些杂质对于确保产品的安全性至关重要。通常检查的杂质包括宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和内毒素。

宿主细胞蛋白

绝大多数治疗蛋白是在非人哺乳动物细胞中生产的。宿主细胞分泌到培养上清中的原生蛋白量很小。然而，随着高细胞密度和长时间的补料分批培养，这些蛋白可能达到影响最终产品纯度的水平。随着培养后期细胞活性的降低，细胞溶解不可避免地导致宿主细胞蛋白的释放。在回收过程中与产物蛋白共纯化的宿主细胞蛋白存在引发患者免疫反应的风险（ 图版 4.4）。此外，污染的宿主蛋白可能包括一些具有酶活性或易于自发化学修饰的蛋白，当这些蛋白在最终药物产品中长时间存在时，可能会导致产品质量的变化。当治疗蛋白的剂量较高时，宿主细胞蛋白（HCP）污染的问题被放大，因为HCP的耐受水平是基于剂量，而不是产品每单位重量。因此，监管机构要求检测和定量宿主细胞蛋白污染。常用的分析方法依赖于免疫分析，如使用针对宿主细胞培养裂解物开发的抗血清的酶联免疫吸附试验（ELISA）。宿主细胞裂解物用于建立定量的标准曲线。

3.产品的结构均一性

细胞培养中生产的蛋白质产品在结构上可能并不完全均匀（ 图版 4.5）。同一蛋白的不同分子上的糖基，或同一分子的不同糖基化位点上的糖基，都略有不同。相比之下，不均一性可能源于一小部分具有变异结构的分子，尽管绝大多数蛋白质分子具有“正常”的结构，包括一级、二级、三级和四级结构。例如，尽管蛋白质翻译的保真度非常高，氨基酸误掺入一级序列的频率很低。在某些培养条件下，如特定氨基酸的缺乏，氨基酸误掺入的频率可能增加，导致可检测数量的变异蛋白。3酶促或翻译后修饰反应，如信号肽切割或C末端赖氨酸切割，可能未完成，导致具有变异结构的产品亚群。

除了由细胞蛋白处理变异引起的变体外，结构变体还可能在蛋白质分泌到培养基后非酶促地产生，或在下游产品回收过程中发生。例如，蛋白质中的二硫键可能被还原、进一步氧化、错配或在不同分子间交叉链接。在细胞培养过程中看到的许多蛋白质变体也在人体中看到。通常，蛋白质的结构异质性或变异是自然发生的。然而，最终产品中它们的变异程度必须控制在规定的范围内。

3.1.糖基化谱

如上所述，蛋白质上糖基结构的异质性与其他蛋白质结构变异有重要的区别。本质上，所有产物蛋白分子应具有相同的一级、二级、三级和四级结构。偏差或变体是异常现象，必须控制在一定水平以下。相比之下，糖基结构的异质性是自然现象，即使在人体合成的糖蛋白中也会发生。当产物蛋白上的糖基被剥离并进行结构分析时，发现不同结构类别的糖基对该蛋白有不同的丰度水平，从而产生糖基分布谱（ 图版 4.6）。蛋白质上的这种分布可能因表达它的组织、患者的健康和年龄等因素而异。对于细胞培养中生产的糖蛋白，糖基谱可能因宿主细胞系甚至使用的特定细胞克隆、培养条件和细胞的代谢状态而异。糖基结构也可能通过降解被修改。例如，可能从死细胞释放的唾液酸酶和其他糖苷酶的存在，导致唾液酸或其他糖基团从糖基上修剪。最终产品糖基谱进一步受到分离和纯化过程的影响，因为不同类型糖基的蛋白质在分离单元操作中的选择性可能不同。在生产过程中控制糖基谱在规定的范围内对于产品释放很重要。

糖基分析

蛋白质分子上不同组成和大小的糖基导致它们在电泳凝胶中的迁移速度出现微小差异（ 图版 4.7）。由于唾液酸带有负电荷，不同唾液酸水平的糖蛋白可以通过等电聚焦凝胶、阳离子交换色谱或毛细管电泳进行分离。这些方法可用于表征糖基，特别是当糖基结构预计不会对其临床疗效产生重大影响时，表征主要用于确保产品质量的一致性。

糖基谱也可以通过利用不同糖基对不同凝集素的不同结合亲和力来确定。糖基化蛋白与凝集素的结合程度可以通过生物素或地高辛标记的凝集素进行检测。使用通常制成阵列格式的凝集素组合，可以收集有关糖蛋白的碳水化合物谱的信息。然而，其分辨率有限，且无法提供完整的结构信息。

为了对蛋白质上的糖基化谱进行结构表征，需要将糖基从蛋白质上分离并进行色谱分离。对于N-糖基，通过用酶解肽-N-糖苷酶F（PNGase F）处理来实现糖基的裂解。然后将游离糖基用2-氨基苯酰胺（2AB）在还原末端N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）处进行荧光标记。在进行清理步骤以去除蛋白质和过量标记试剂后，用液相色谱（如亲水作用色谱HIC）分离荧光标记的糖基。计算糖基的相对%峰面积，并提供各种糖基物种的相对丰度。然而，没有相应的酶促处理可以释放丝氨酸或苏氨酸上的O-糖基。释放完整的糖基在O-糖基的结构分析中仍然是一个主要挑战。化学处理可以释放这些糖基，但它也改变了糖的结构，使得标记和提高检测灵敏度变得困难。因此，O-糖基分析落后于N-糖基分析。从结构上看，蛋白质上的O-糖基可能比N-糖基复杂得多。O-糖基的复杂程度由细胞或组织中表达的糖基化基因决定。许多O-糖基化蛋白位于细胞表面。CHO细胞中表达的一些蛋白质是O-糖基化的，但是，尽管参与O-糖基化的酶种类繁多，CHO细胞中表达的数量相对较少，相应的O-糖基结构上也较不复杂。当用荧光标记标记时，糖基的相对面积/峰高给出了整个蛋白质中不同糖基的相对丰度水平（图4.4）。然而，当蛋白质中存在多个糖基化位点时，它并不提供位点间的分布信息。可以使用蛋白酶将蛋白质消化成肽段，分离和纯化糖基化肽段，然后使用质谱法确定m/z比率，并确定每个糖基化位点的糖基分布。然而，如果有超过两个位点，分析可能会相当复杂。即使如此，这种分析也不提供同一蛋白质分子上一个位点上的糖基与其他位点上的其他糖基共表达的信息。如果有一种基于单分子的分析方法，那么蛋白质分子上的这种链接糖基分布将很容易获得。

图 4.4. 洗脱的N-糖链的色谱图。

3.2. 蛋白质结构变体

一些蛋白质变体的氨基酸序列发生了变化。这些在一级序列中的变化可能通过蛋白质或转录后处理中的罕见错误生物学地发生，或通过化学修饰（ 图版 4.8）发生。一些主要非生物学发生的事件改变了蛋白质的高阶结构，如二硫键错配或聚集体的形成。

通常，根据常规使用的蛋白质表征方法对蛋白质产品的变体进行分组。大小（或聚集体）变体是在尺寸排除色谱中出现为大分子重量峰的变体。电荷变体是那些从离子交换色谱中洗脱并出现为单独且较小的峰的分子，或者在等电聚焦中形成单独的条带。如上所述，糖蛋白的糖基化模式通常是异质的，但在生产过程中可能是可变的。一些人认为糖基谱的偏差或超出规定的范围是结构变异。总的来说，结构变体在蛋白质产品中所占比例相对较小。这些变体可能在蛋白质分子分泌前在细胞内产生，或在分泌后化学或生化修饰。这些变体对蛋白质的免疫原性、效力和效力的影响已在文献中描述。

一级序列变体

产品蛋白质的一级序列变体可能源于编码生产细胞中产物基因的DNA序列的突变。在体细胞复制期间蛋白质编码序列的突变率相当低。如果产物基因中存在任何突变，它可能源自一个单一的细胞，并且只发生在编码产物的多个序列副本中的一个中。通常在建立细胞系的细胞库之前进行测试，以确保生产细胞中没有这种异常。一级序列中的错误不太可能由转录错误引起，因为这种错误的频率很低。在RNAseq中以低频率看到未剪接的RNA物种，因此产品转录本中发生类似事件的概率也非常低。如果翻译了这样的转录本，它很可能会产生一个错误折叠的蛋白质并被降解。具有一级序列变体的产品更可能源于翻译错误。如果培养基中某种氨基酸缺乏，可能会使用不匹配的氨基酸来充电tRNA，导致错误充电的氨酰-tRNA将错误的氨基酸带入延伸中的蛋白质分子。

其他氨基酸序列变体可能在翻译后发生。以低频率，指导新生蛋白质转位到内质网的前导序列可能不会被剪切，产生变体。许多蛋白质在其C-末端含有赖氨酸或精氨酸。C-末端的基本氨基酸容易受到羧肽酶的剪切。许多IgG分子重链C-末端的赖氨酸被羧肽酶剪切通常不完全，留下一些分子的C-末端赖氨酸未被剪切。

化学修饰的结构变体

许多结构变体是通过氨基酸的化学修饰产生，而不涉及细胞酶的参与。这些化学修饰主要发生在蛋白质分子分泌到细胞外环境中。然而，赖氨酸的氨基或N-末端氨基酸可能在细胞内环境中与琥珀酸或延胡索酸反应，尽管这似乎不常发生。去氨基作用，或酰胺基团的移除，可能发生在天冬酰胺中形成琥珀酰亚胺或进一步水解为天冬氨酸或异天冬氨酸（图4.5a）。C-末端谷氨酰胺可以环化，失去其酰胺基团并形成焦谷氨酸（图4.5b）。糖基化，即葡萄糖或其他还原糖与赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基酸的氨基发生缩合，会在培养液中自发发生（图4.5c）。蛋氨酸残基可能通过与活性氧物种反应被氧化形成蛋氨酸亚砜（图4.5d）。

图 4.5. 产生蛋白质结构变体的化学修饰。(a) 天冬酰胺的脱酰胺作用。(b) 谷氨酰胺向焦谷氨酸的转化。(c) 赖氨酸的糖基化。(d) 蛋氨酸的氧化。

更高阶的结构变体

除了改变一级结构中氨基酸的各种化学修饰外，蛋白质中的二硫键也可能以不同的方式进行结构修饰。二硫键具有相对较低的解离能。一些二硫键位于蛋白质的结构灵活区域，容易受到可能导致断裂、三硫键形成等的化学修饰。二硫键也可能打乱其排列，经常引起蛋白质分子的重大构象变化并诱导聚集。蛋白质聚集也可能源于其他机制。例如，蛋白质中的β-折叠二级结构在分子内或分子间相互作用，有助于三级和四级结构的形成。分子间相互作用的错位可能在细胞培养环境中发生，特别是在后期给料培养的极端条件下。一些下游处理条件，如低pH，会加速聚集体的形成。二硫键的化学修饰可以通过质谱的肽指纹图谱检测。聚集或蛋白质大小变体可以通过尺寸排除色谱法识别。这种色谱法根据蛋白质的水动力学体积差异进行分离。具有较大水动力学体积的分子比具有较小体积的分子更早地被洗脱。蛋白质样品被加载到尺寸排除柱上，等度分离，并通过UV吸收监测洗脱液。通过计算每个分离组分的百分比与总积分面积的比较，提供相对丰度。

3.3. 电荷变体

各种结构变体的存在和丰度水平可以通过质谱的肽指纹图谱或其他仪器分析来表征。然而，对于常规评估，它们通常通过更容易获得的测定方法进行评估，如尺寸排除色谱和离子交换色谱。蛋白质在其氨基酸中携带许多带电侧链。在生物pH下，大多数蛋白质带弱电荷。蛋白质分子的净电荷变化可能导致其稳定性和活性的变化（ 图版 4.9）。带电变体可能具有改变的与其目标受体或抗原的结合亲和力。

因此，重要的是要对产品蛋白质的基本或酸性电荷变体进行表征和控制，在指定范围内。电荷变体可以分为酸性和基本电荷变体。前者在阳离子交换色谱（CEX）中比主产品峰提前洗脱，或在阴离子交换色谱（AEX）中之后洗脱，这意味着它们具有更高水平的带负电的酸性基团（图4.6）。基本电荷变体是在CEX中主产品群之后洗脱或在AEX中之前洗脱的那些。操作上，电荷变体由其在AEX或CEX中的洗脱剖面定义。通常，在设定的pH下，带电变体在阳离子或阴离子交换柱上分离，并使用盐梯度洗脱。洗脱液通过UV吸收监测。通过确定每个变体的峰面积作为总峰面积的百分比来评估电荷变体分布。需要注意的是，蛋白质在AEX和CEX中的洗脱剖面是由分子在色谱中的结合亲和力决定的。结合亲和力不仅受分子的电荷影响，还受蛋白质构象和许多其他因素的影响。这与等电聚焦（IEF）形成对比。IEF探测蛋白质的等电点（pI），或蛋白质没有净电荷的pH。具有不同等电点的变体在IEF凝胶中形成与标准产品蛋白质不同的独特带。一些不影响蛋白质等电点的变化，如蛋氨酸的氧化和二硫键的重排，可能会改变蛋白质的结合亲和力，并导致其在离子交换色谱图中出现作为单独的次要峰。作为酸性和基本电荷变体出现的不同的结构变体列在 图版 4.10中。

图 4.6. 阳离子交换色谱中蛋白质电荷变体的洗脱。

4.生物活性

4.1.功能测定

如上所述的结构表征评估了产品中各种异常的数量。其中一些变化可能引起安全问题或影响产品的效力。例如，二硫键的错排可能会引起免疫反应。其他一些变化，如糖基化和未切割的C-末端赖氨酸，在血液中的不同蛋白质和不同水平上都可以看到，可能不会构成主要的安全问题。在产品表征中，不同的结构变异被单独测定，并作为整个产品的百分比报告。当不同的改变同时发生在一个分子中时，对安全性或效力的影响可能与这些变化发生在不同分子时不同。然而，目前的蛋白质表征方法并未揭示不同结构变体的组合及其分布概况。在完全将结构变化与功能变化联系起来方面存在很大的差距。因此，蛋白质产品的完整表征必须包括以生理相关的方式测量功能活动。蛋白质产品可能通过其催化活性发挥作用，例如葡萄糖脑苷脂酶的主要功能是切割特定的糖苷键。产品蛋白也可能通过与体内液体中的配体结合、与细胞表面受体结合触发下游信号响应，或通过阻断其生物对应物的竞争性结合来发挥作用。功能测定可能涉及量化产品的酶活性、测量产品与配体的结合强度，或使用效应细胞进行生物测定。在所有情况下，根据对分子的作用机制（MOA）的理解选择适当的测定方法。结合测定 由于单克隆抗体（mAbs）是最大的治疗蛋白类别，抗原与抗体之间的结合测定是一种常见的功能测定。通过表面等离子共振（SPR）测量结合动力学（图4.7）。首先，配体蛋白被固定在传感器芯片上。然后，抗体蛋白流入配体包被的结合反应室，允许测量抗体与配体的结合。这之后是解离期，通过流动不含抗体的溶液来测量解离动力学。在配体的表面固定再生后重复该过程。在结合阶段，随着抗体和配体形成复合物，表面共振增加，在解离阶段减少。利用结合动力学方程，可以确定结合和解离的速率常数。

图 4.7. 表面等离子共振（SPR）中配体的吸附和解吸动力学。

4.2.生物测定

使用培养细胞量化蛋白质生物活性的生物测定是对产品最直接的评估，仅次于使用动物。它能够定量评估蛋白质变化对其生物活性的影响。但有效的生物测定也很难且耗时开发。它依赖于对药物作用机制的良好理解。图4.8a和b展示了抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体介导的细胞毒性（CMC）的测定示例。在A DCC中，使用了两种类型的细胞，效应细胞和靶细胞。靶细胞表达抗体识别的抗原。抗体与靶细胞的结合招募了杀手细胞，后者对靶细胞施加细胞毒性作用。在CMC中，抗体与靶细胞表面的抗原结合招募了补体。然后补体与靶细胞的结合引发补体介导的细胞溶解。有了有效的生物测定，就可以评估不同剂量的抗体活性（图4.8c）。在生物测定中一致的动力学行为保证了产品的质量。如果产品批次显示出生物测定响应曲线中所示的改变了的行为，则需要进一步调查。结合测定和生物测定的一个常见要求是参考产品和测定材料的可用性。对于结合测定，参考材料是产品和配体分子。对于生物测定，测定细胞必须标准化、储备，并随时可用。生物测定通常受到更高程度的变异性影响。这些额外的挑战使得生物测定的使用频率低于化学和结构表征。

图 4.8. 抗体介导的靶细胞杀伤的生物测定。(a) 抗体依赖性细胞毒性测定。(b) 补体介导的细胞毒性测定。(c) 在有和没有结合靶细胞的抑制剂的不同剂量下的杀伤结果。

5.质量源于设计（QbD）在细胞培养产品中的应用

过程和产品开发的一个重要目标是生成对过程和产品质量的理解，并定义在制造过程中监控和控制产品质量的策略。蛋白质结构的变异性强调了识别影响产品安全性和效力的可变性属性的重要性，以及需要在一定范围内控制这些属性的必要性。

在21世纪初，FDA发布了关于21世纪cGMP的一系列文件，并开始推动将QbD纳入药物开发和制造中（图4.9）。这些文件中，包括ICH Q8（R2）（药物开发）、ICH Q9（质量风险管理）、ICH Q10（药物质量体系）和ICH Q11（药物物质的开发和制造），为生物制品行业适用的QbD的范围和定义提供了高层指导。这些文件还引入了许多项目，列在 图版 4.11中。

图 4.9. 将质量源于设计(QbD)纳入工艺开发和制造中。

QbD是一种过程开发方法，其中制造过程和控制被主动设计为交付预期的产品。QbD要素包括：确定药物产品的关键质量属性（CQAs）的质量目标产品档案（QTPP）；过程设计和理解，包括识别关键过程参数（CPPs），将CPPs与CQAs联系起来；包括药物物质和药物产品的质量规范以及对每个制造步骤的控制的控制策略；以及过程能力和持续改进。QbD工具包括先前知识、风险评估、机制模型、实验设计（DoE）、数据分析和过程分析技术。

基于QbD的药物开发实施始于定义实现安全性和临床效力所需的药物产品特征。这组产品特征被称为质量目标产品档案（QTPP）。接下来，识别药物产品和药物物质的物理、化学、生物或微生物特征，这些特征必须在一定范围内控制，以确保满足QTPP。这些特征，称为关键质量属性（CQAs），是可测量和量化的变量。这些CQAs如何受到不同操作制造过程条件的影响，可以从过程知识中确定或通过实验确定。这些信息用于定义一个过程变量的设计空间，在这个空间内，产品的CQAs可以预期进入允许的范围。然后建立一个控制空间，在该空间内操作过程，从而确保最终产品的CQAs满足规范。

采用基于QbD的方法，风险分析被用来评估可能导致CQAs偏离界限的各种过程异常，并采取措施降低风险。QbD的实施从过程开发的开始，并持续到表征、建立和商业制造。它在整个产品生命周期中不断实践，以不断改进过程和提高产品质量。

实施QbD的首要任务是开发对过程参数（例如，原料、细胞接种物）、培养条件和产品质量之间关系的知识。这些关系必然是复杂的，有多个交互输入变量和过程参数，这些参数影响生产力和产品质量。理解过程参数和产品质量之间的关系至关重要的分析工具，这些工具量化各种质量变量。分析技术的进步使得对物理化学属性、生物活性、免疫化学属性、纯度和杂质进行复杂的评估成为可能。

监管文件（例如，ICH Q6B）规定了生物技术/生物产品的测试程序和接受标准。表4.2显示了一些质量属性，这些属性的类别由监管机构定义，通常用于表征临床产品的分析方法，以及在过程开发研究中产生的材料。

6.QTPP和CQAs

基于QbD的产品和过程开发首先考虑最终药物产品的期望或目标质量特征（QTPP），根据它将如何给患者给药以及它必须具备什么特性才能安全有效。表4.3显示了一个重组抗体药物产品的QTPP示例。QTPP将用于确定产品的CQAs。对于每个特征，给出定性目标描述或定量措施。乍一看，这个列表似乎没有提供太多与安全性和效力相关的药物物质特征的信息。仔细检查将揭示产品的质量要求。

药物产品必须在冷藏条件下以25 mg/mL的浓度作为液体稳定至少两年。药物物质在处理过程中还必须在室温下稳定14天，并且浓度更高。由于在保质期结束时降解产物和杂质必须低于安全阈值，因此需要长期稳定性。这些产品规范指向蛋白质稳定性的重要性。因此，药物产品聚集的倾向，以及电荷变体的水平可能会影响QTPP。将要静脉注射的剂量和浓度很高。这表明宿主细胞蛋白和其他杂质的水平可能会影响产品的安全性。

表4.4是重组抗体产品的部分质量属性列表。一些属性，如pH值和辅料浓度，与药物产品的组成和强度有关。必须在低水平控制一些与杂质或结构变异有关的属性，以确保满足QTPP的降解产物和杂质方面。

从QTPP衍生的质量属性列表可能会相当长，如表4.4所示的例子。然而，并非所有已识别的属性都是关键的，必须在一定范围内控制，以最小化对临床结果产生负面影响的风险（ 图版 4.12和4.13）。在产品和过程开发期间，以及在制造过程建立和过程与临床数据可用之前，通常进行识别所有属性中的CQAs的任务。选择过程在很大程度上依赖于对过去产品和过程的了解，以及对产品的作用机制（MOA）的理解。执行新候选药物的MOA的文献综述，并调查类似产品的数据库。例如，如果单克隆抗体产品的机制是阻断受体位点，增强抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）的属性可能对效力并不重要。因此，Fc区域的岩藻糖基化可能不被视为CQA。另一方面，如果MOA是ADCC，Fc区域的糖基化水平可能被选为CQA。

人们越来越努力采用评分系统来选择CQAs。多功能团队的每个成员对属性进行评分。每个属性根据其对实现QTPP的重要性给出一个影响分数，并给出一个“不确定性”分数，以考虑属性的变异程度。然后根据总分数选择CQAs。随着产品的推进和临床及体外研究经验的积累，使用产品的降解途径和结构-活性关系的知识来完善CQAs。本章后文将讨论采用风险评估程序的审慎方法。一般来说，识别CQAs及其界限是一个随着产品通过商业化生命周期而完善的迭代过程。

CQA范围和验证

在选择了CQAs之后，必须为每个CQA指定适当的值或值范围。决定CQAs的值是一项艰巨的任务，特别是在产品开发的早期阶段，当没有足够的临床和制造数据时。在过程开发的早期阶段和QbD建立时，使用体外结合测定和生物测定的数据来评估不同范围的CQAs对产品性能的影响。由于药物物质生产过程通常在一定范围内产生各种变体，为了测试超出典型范围的条件，使用极端应力条件来加速一些结构变体的产生，如降解产物和聚集体。包括带电变体在内的一些变体可以被富集或纯化，用于体外或小动物的测试。来自体外和体内研究的数据与已建立的药物产品的历史悠久数据一起，在最初定义CQA值时使用。在为制造完善CQAs时，重要的是要纳入在不同设置下生产的大量产品批次，以更好地识别CQAs并设置放行规范。除了开发和临床制造批次外，也可能包括在极端条件下产生的“极端”变体水平的批次。

图4.10显示了一个假设情景，使用结合测定、生物测定和PK来了解变体对产品效力的影响。在产品开发的早期阶段，可以使用各种测定来设置CQAs的范围。随着临床试验的临床批次变得可用，并且临床研究的进行，数据可以用来支持为临床制造批次选择的CQAs范围。重要的是要生成一个全面的样本库，特别是随着过程的发展在更大规模上产生的样本，以便最终验证的生物测定可以在最终CQAs和规范设定之前尽可能多地表征开发和临床批次。

图 4.10. 一个假设的例子，使用不同检测的质量评分来选择关键质量属性（CQA）的规范。

在评估产品属性的可接受范围时，需要考虑在给药给患者时可能会发生产品的重大修改。例如，已知蛋白质的去酰胺化在血液中发生。使用模型或通过测量预测这种属性变化将产生支持选择更宽范围的CQA值的数据。

6.1.不同制造阶段的CQAs

治疗蛋白的制造过程可分为四个阶段：药物物质制造（包括生产、下游回收和纯化）；药物物质处理；药物产品制造；和药物产品处理（图4.11）。每个阶段进一步包括不同的单元操作。大部分生产发生在药物物质制造阶段。然而，最终药物产品直接影响患者的安全性和效力，并且最终药物产品是为QTPP设计的。CQAs的值可能在整个制造过程中并不恒定。随着产品流通过不同的制造阶段，产品的纯度和可能的均匀性将增加，CQA值应接近药物产品的最终值。例如，如果蛋白质聚集是CQA并设定在阈值以下，随着产品通过收获和纯化，聚集体的比例应该减少。CQA可能只在制造过程的某个阶段之后才变得重要。例如，由于暴露于低pH条件而产生的特定类型的产品变体，它出现在下游加工中但不在生产生物反应器中。全面了解不同制造阶段的CQAs有助于设定围绕CQAs的设计目标或规范，产品需要满足这些规范。

图 4.11. 关键质量属性在制造各阶段的变化。

6.2. 过程开发前的质量考虑

日益增多的质量评估被纳入与药物生产相关的各种决策中，有时甚至在过程开发开始之前，因为一些决策将影响未来制造中产品质量的稳健性（ 图版 4.14）。

例如，有时可能会考虑多个候选分子用于相同的药物，如在补体决定区（CDR）具有稍微不同原始序列但结合相同抗原的抗体。在设计和选择领先的单克隆抗体和其他蛋白质治疗候选物时，会考虑产品质量、稳定性和平台适应性。例如，这些分子形成蛋白质聚集的倾向可能不同。选择一个聚集倾向低的分子将减少过程的产量损失，并可能影响长期产品稳定性。

另一个例子是蛋白质溶液的粘度，这可能影响蛋白质治疗的递送。

用于生物制造的生产细胞系都经过克隆选择。不同的细胞克隆在生产力方面以及许多影响产品质量的属性上往往有些变化。不同克隆生产的产品可能具有不同的特征，这些被认为是CQAs，如岩藻糖基化或聚集倾向。在选择用于制造的克隆时考虑这些质量因素。表4.5是一个评分表的例子，它评估影响细胞系稳定性（整合位点、拷贝数、表观遗传稳定性）、生产力（生长速率、滴度、特定生产力）和产品质量属性（序列变体、聚集、结构变体、糖基化、CDR的修饰）的因素。为不同的特征分配不同的权重，总体得分用于选择最佳克隆，以确保“可制造性”并降低CQAs超出范围的风险。

7.质量风险管理

质量风险管理（QRM）是系统评估、控制、沟通和审查整个产品生命周期中药物产品质量风险的过程。虽然定量风险可能以不同的方式计算，但评估基本上包括识别和评估产品表征、过程开发和临床经验中的总危害。在开发产品时启动QRM过程，通常组建一个跨职能团队，该团队收集有关产品和过程的背景信息和数据，并确定可用的工具和时间表（图4.12）。然后执行风险评估，以识别可能影响CQAs的危害或过程故障模式。然后评估给定故障模式发生的可能性。最后，风险根据标准进行评估和分类，通常使用半定量评分系统或将其归类为低、中、高风险。在QRM中可以使用许多工具和类型的风险评估。

图 4.12. 质量风险管理的一般流程图。

一旦风险被识别和分类，团队就确定已识别和分析的风险是否可以接受。如果不是，调查并更好地了解危害的可能性和影响，然后确定采取行动以减少或消除风险。这些减少危害的严重性和可能性的行动通常包括增加危害的可检测性。在某些情况下，残余的低水平风险被认为是可以接受的。QRM过程的输出通常是一份文档，总结风险评估分析和采取的风险控制行动。然而，这份文档只是完成时可用知识的快照。当被认为是不可接受的风险被缓解时，完成另一轮风险识别、分析和评估，以确保评估引入的任何新风险或现有风险的重要性增加。此外，应定期审查风险，以确保考虑新知识和经验。

7.1.风险缓解

在识别风险后，制定了缓解手段（表4.6）。可以采取严格的风险管理方法，使用诸如石川（鱼骨）图、因果分析或故障模式和影响分析（FMEA）等工具。

在调查过程变量与质量属性结果之间的关系时，始终明智的做法是首先审查历史数据。例如，过程的持续时间可能被确定为可能影响CQA宿主细胞蛋白含量的因素。可以启动历史数据的调查，以确定HCP超过设定值的频率，针对有问题的过程时间段。为了促进风险和效益分析，还分析了生产力和其他过程变量的数据。然后可以就已识别的过程变量的风险管理计划做出决定。调查后，选择对CQAs影响较大的较少数量的过程参数进行更详细的实验表征，并生成一个量化它们对CQAs的影响的模型，无论是单独的还是交互的。这是在对CQAs的变异性做出贡献的单元操作上执行的。

风险评估在产品和过程开发阶段启动，并用于定义过程参数的操作（控制）空间。评估在整个过程表征和性能验证阶段持续并更新。即使在常规制造之后，它也贯穿于产品生命周期管理阶段。

7.2. 知识管理

QRM的一个重要组成部分是从数据中创造知识，以及随后利用和传播这些知识（图4.13）。从一开始，就从公共文献、内部机构文件（包括以前的监管提交）和知识数据库中捕获有关产品和过程的先验知识，以供QRM使用。随着产品开发的进展，从非临床和临床研究中产生有关产品安全性和效力的信息，CQA风险评估得到更新。过程开发研究和临床制造也在商业化之前产生额外的知识。一旦产品上市，商业制造经验和技术转移到替代制造设施，创造了大量关于过程参数和CQAs之间关系的知识。编制、分析、存储和传播上述所有知识的过程，称为知识管理，对于持续提高产品质量至关重要（ 图版 4.15）。许多公司使用电子表格、数据库和专业软件，以确保以高效的方式管理知识。一些公司创建过程库，包括标准化的风险评估和过去过程开发经验的数据汇编。信息技术（IT）工具，如Biovia Discoverant®和Tibco Spotfire®，可以用作知识管理工具，以聚合大型数据集。

图 4.13. 将风险管理纳入工艺开发、制造和生命周期管理中。

8.设计空间和控制策略

QbD的最终目标是建立一个制造过程，产生符合QTPP和CQAs的产品。在药物开发的QbD术语中，这是通过定义过程设计空间来实现的。在过程开发中，映射和定义设计空间是一项重要任务（ 图版