正文
撰文 | 王文博
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卡尔﹒朱恩（Carl June）教授团队无疑是在临床上使用CAR-T技术最成功的团队。他们最早将CAR-T技术成功应用于临床，治疗的病人多且数据翔实，积累了多年的临床实践经验和成功经验，成果也最突出。CAR-T技术本身并不是一种很新的技术（第一代CAR-T上世纪80年代就开发出来了
，
二代CAR-T在2003年-2004年期间被报道出来），最初的设计也并不是出自该团队之手。朱恩团队在2003年才从坎帕纳（Dario Campana）教授手里拿到现在使用的antiCD19CAR质粒。此外，朱恩教授进入癌症免疫治疗领域也相对较晚。但为什么朱恩团队能够如此成功的在临床上应用CAR-T技术呢？笔者认为，除选择了很好的靶点CD19和使用了更高效的二代CAR结构外，他们的成功与下面四点分不开。
第一
，完备的团队及良好的合作关系。朱恩团队成员分工合作，研发、生产、临床治疗、分析检测配合紧密，是转化医学中团队配合的典范；
第二
，团队在T细胞体外培养、使用病毒对T细胞进行基因改造、血液病治疗及骨髓移植领域有数十年的经验积累，因此在临床上开发antiCD19CAR-T技术和治疗血液癌症时更得心应手；
第三
，顶级的细胞生产平台和转化医学研究平台。宾夕法尼亚大学（下文简称宾大）临床细胞和疫苗生产中心（Clinical cell and vaccine production facility，CVPF）是符合FDA cGMP标准的细胞生产中心，负责生产宾大临床试验使用的CAR-T细胞。CVPF管理科学，经验丰富，保障了T细胞产品的临床转化。宾大良好的转化医学研究基础和氛围也为朱恩教授团队提供了很好的发展平台。2013年，宾大又建成了斯米洛转化医学研究中心（Smilow Center for Translational Research），为其转化医学的进一步发展奠定基础；
第四
，早期来自于美国国立卫生研究院（NIH）的资金支持和后期诺华的大力支持。细胞治疗产品的研发投入很大，尤其是在临床阶段。美国国立卫生研究院(NIH)的资金很难支持临床转化阶段的研究。NIH以外的资金包括公司和协会的投入是临床转化阶段不可或缺的重要资金来源。
笔者认为，基于以上四点，朱恩教授团队在CAR-T技术的临床应用上取得了首创的、举世瞩目的成绩。
下面主要分四部分来详细介绍朱恩团队及宾大的研究平台，以期让读者对朱恩团队CAR-T技术的研发和生产有更深入的了解：一、团队成员的背景和主要职责；二、宾大antiCD19CAR-T的研发历程；三、宾大临床试验的核心机构CVPF；四、宾大转化医学研究中心Smilow Center for Translational Research。
朱恩教授团队2009年-2013年的主要成员有卡尔﹒朱恩教授，布鲁斯﹒莱文（Bruce Levine）教授，大卫﹒波特（David Porter）医生和米歇尔﹒卡洛斯(Michael Kalos)博士。这四位主要成员是antiCD19CAR-T成功的关键。简单地说，朱恩教授负责早期研发、经费募集和临床试验的总体规划，莱文教授负责CAR-T生产，波特医生负责接收和治疗病人，卡洛斯博士负责试验设计和临床样本的分析。
朱恩教授:
对HIV感染和T细胞激活研究贡献卓著
朱恩教授1971年进入美国海军军官学院(Naval Academy)，接受骨髓移植的培训。1975年，朱恩教授进入贝勒医学院（Baylor College of Medicine）学习，并在1979年获得医学博士学位。1983年至1986年期间，朱恩教授跟随E﹒唐奈﹒托马斯博士（E.Donnell Thomas博士,1990年因其在造血干细胞移植方面的贡献获得诺贝尔医学奖）和约翰﹒汉森博士（John Hansen博士，造血干细胞移植耐受专家）在弗莱德·哈金森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）进行博士后研究。
在上世纪80年代中期，朱恩教授的研究逐渐转向T细胞。上世纪90年代中期，朱恩教授和基因治疗公司Cell Genesys合作使用转基因T细胞治疗艾滋病。一直到1999年，朱恩教授才来到宾大，工作至今。在来到宾大时，朱恩教授及其合作伙伴已经可以在体外大规模的培养T细胞，并能够使用病毒来改造T细胞。虽然有行医资格，但是现在朱恩教授不再为病人看病，而是专心于开发更好的免疫治疗方法。他自己的实验室吸引了优秀的人才，实验室规模也在逐年扩大。另外，朱恩教授课题组还包括一个临床试验组（Clinical Trial Unit）。
从上面的介绍不难看出，朱恩教授本人是医生也是科学家，他在早期一直研究骨髓移植，后来转到使用体外激活的T细胞和转基因T细胞治疗艾滋病，直到来到宾大以后，朱恩教授的研究兴趣才真正转到使用转基因T细胞治疗癌症，尤其是血液癌症。此外，朱恩教授还研究了CD28和4-1BB等共激活信号通路对T细胞激活的影响，有很多经典文章发表。他对HIV感染和T细胞激活的研究有很大的贡献。多年T细胞体外大规模扩增和使用慢病毒对T细胞进行转基因操作等的经验为他后来的成功奠定了理论和技术基础。
布鲁斯﹒莱文教授:
保证临床试验材料的制备
莱文教授是宾大CVPF的负责人。他1984年毕业于宾大，获得生物学学士学位。1986年至1992年期间，他在约翰斯·霍普金斯大学（The Johns Hopkins University） 学习和研究免疫学和感染性疾病，并获得PhD学位。1992年至1999年，莱文教授在海军军医大学（Naval Medical University）和亨利﹒M﹒杰克逊基金会（Henry M. Jackson Foundation）跟随卡尔﹒朱恩教授进行博士后培训，期间他主要研究了CD28信号通路对T细胞的激活作用，并开发和使用了负载CD3和CD28抗体的Dynabeads，用来刺激T细胞大量扩增。
在此期间，他和朱恩教授建立了早期的合作关系。1999年，莱文教授来到宾大开始担任CVPF的负责人并工作至今。在CVPF，莱文教授主要负责管理临床试验需要的细胞产品和疫苗的生产。自1996年以来，莱文教授直接负责了2700个细胞产品的生产和检测，超过1000个病人使用了这些产品。
莱文教授有多年体外大规模激活扩增T细胞以及使用慢病毒转染T细胞的经验。他又有多年细胞和疫苗的GMP生产经验和管理经验。临床产品的生产和实验室的研究有很大区别，不仅需要特殊的仪器和耗材等，使用的规则和标准也有很大差别。临床试验还有更严格的QA程序和管理。莱文教授对朱恩教授团队antiCD19CAR-T成功的主要贡献是保证了符合FDA标准的临床试验材料的制备，为CAR-T的生产提供保障。
大卫﹒波特医生：
主导临床使用
波特医生目前供职于宾大医院，专注于血液病的治疗。他目前是宾大血液和骨髓移植中心（Blood and Marrow Transplantation）的负责人。波特医生于1987年在布朗大学获得医学博士学位。1987年至1990年期间，他先后在波士顿大学医院（University Hospital, Boston）担任实习医师（Medical intern）、初级助理驻院医生（Junior assistant resident）、高级助理驻院医生（Senior assistant resident）。1990年至1993年，波特医生在布列根和妇女医院（Brigham and Women’s Hospital）和哈佛医学院担任血液/肿瘤科(Hematology/Oncology)的临床研究员（Clinical/Research fellow）。
波特医生在血液病领域从业近30年，擅长治疗多种血液病尤其是血液类癌症。波特医生是antiCD19CAR-T早期临床试验的主要研究者（Principal Investigator），负责临床部分的工作。波特医生为antiCD19CAR-T早期成功的临床应用提供了有力保障。
米歇尔﹒卡洛斯博士：
临床样本分析和数据总结
卡洛斯博士在明尼苏达大学医学院（University of Minnesota Medical School）的微生物学院获得PhD后，1990年在福瑞德·哈金森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）接受博士后培训，他当时的主要工作是使用转基因技术改造淋巴细胞靶向性。1997年，他加入Corixa Corporation，负责开发一种可治疗前列腺癌和肺癌的新疫苗。2004年，他加入City of Hope建立了GLP标准实验室，负责最新细胞免疫治疗方法的开发和应用。
2008年，卡洛斯博士来到宾大，建立了转化与相关研究实验室（Translational and Correlative Studies Laboratory）。卡洛斯博士建立了系统的临床样本分析方法，对antiCAR-T19项目的临床评价和后续开发做出很大贡献。2013年，卡洛斯教授加入礼来，担任癌症免疫治疗首席科学官，主要负责建立和开发更高效的免疫治疗产品。卡洛斯博士对早期antiCD19CAR项目的主要贡献在于临床样本的分析和数据总结。
除此之外，朱恩教授团队还有其他优秀的科学家，因篇幅限制，在以后的文章中将向大家一一介绍。
David Porter,Bruce Levine,Carl June,Michael Kalos / 图片来源：
Philadelphia Magazine
AntiCD19CAR-T的开发和应用并非偶然，如前一篇文章所述，很多科学家都做出了重要贡献。宾大CTL019CAR-T的成功离不开人类对T细胞的信号通路、T细胞大规模体外扩增、对T细胞进行基因改造和规范的临床GMP生产流程等知识和技术的积累。虽然antiCD19scFv-41BB-CD3Zeta设计并非朱恩教授团队的成果，但是能将AntiCD19CAR-T成功应用到临床也绝非易事。下面来简要梳理一下宾大CTL019的研发历程。
1.
上世纪90年代，朱恩教授团队经多年研究，发明了包被CD3和CD28抗体的磁珠，用于体外大规模激活T细胞。朱恩教授关于在体外高效激活T细胞有很多文章和专利，其中专利US5858358 A和US6352694 B1，以及1996年发表于《科学》上名为“Antiviral effect and ex vivo CD4+ T cell proliferation inHIV-positive patients as a result of CD28 costimulation”的文章最有代表性。
抗体包被的磁珠激活T细胞 / 图片来源：宾大CVPF网站
2.
朱恩教授自上世纪90年代末就开始与Cell Genesys公司合作，使用源于HIV病毒的Lentivirus修饰改造T细胞。
HIV侵染T细胞 / 图片来源：Interacttive Biology网站
3.
2003年，朱恩教授与坎帕纳（Campana）教授在一次会议上认识并建立了联系。经协商，朱恩教授和宾大与坎帕纳教授和圣裘德儿童研究医院签署协议（MTA）。按照协议，坎帕纳教授提供了antiCD19CAR质粒（antiCD19scFv-41BB-CD3Zeta）给朱恩教授。
4.
2004年，圣裘德儿童研究医院的坎帕纳教授在《白血病》（Leukemia）杂志上发表名为“Chimeric receptors with 4-1BB signaling capacity provoke potentcy totoxicity against acute lymphoblastic leukemia”的文章，首次报道antiCD19CAR-T细胞（antiCD19scFv-41BB-CD3Zeta）治疗ALL的潜力。坎帕纳教授也申请了相应专利（US 2005/0113564 A1/WO 2005044996 A2）。
5.
2009年，朱恩教授团队在《分子医学》（Molecular Therapy）杂志上发表名为“Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy InVivo”的文章，证实antiCD19CAR-T细胞可在体外和体内高效的杀伤人Pre-B ALL癌细胞。同时，该文章比较了41BB共刺激域和CD28共刺激域对antiCD19CAR-T活性的影响，文章指出antiCD19scFv-41BB-CD3Zeta结构要优于antiCD19scFv-CD28-CD3Zeta。坎帕纳教授是该文章的共同作者之一。另外，同样是2009年，朱恩团队在《美国科学院院报》（PNAS）上发表名为Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human Tcells containing CD28 and CD137 domains的文章。该文报道了CAR-T治疗实体瘤的潜力，也是朱恩团队将CAR-T应用于治疗实体瘤的早期尝试之一。
6.
2011年，朱恩教授团队在《科学
﹒
转化医学》（Science Translational Medicine）杂志发表名为“T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia”的文章，证实antiCD19CAR-T可在人体内治疗晚期CLL（advanced CLL）。在报道的三个病人中，有两个病人为完全缓解（CR），另外一个病人为部分缓解（PR）。
7.
2011年，朱恩教授团队在新英格兰医学杂志（NEJM）发表名为“Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia”的文章，报道了一例antiCD19CAR-T治疗难治型CLL（Refractory CLL）的病例。本研究使用了低剂量的CAR-T细胞治疗病人，经治疗后，病人获得完全缓解，缓解时间持续10个月以上。
8.
2012年，被称为Poster girl的艾米莉﹒怀特海德（Emily Whitehead）入组了在CHOP进行的临床试验。艾米莉患B-ALL，曾多次复发。在使用antiCD19CAR-T以后，艾米莉被治愈，至今仍然很健康。
9.
2013年，朱恩教授团队在新英格兰医学杂志上发表名为“Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia”的文章。该文章报道了antiCD19CAR-T治疗的两例儿童复发难治性pre-B ALL（Relapsed and refractory pre-B ALL）病人，两例病人都经历了严重的细胞因子释放综合症，但都获得了完全缓解（CR）。其中有一名病人的缓解时间超过11个月。另一名病人在治疗两个月后复发，新出现的blast cell（原始未分化的血细胞，常见于急性白血病）出现CD19表达缺失。这可能是复发的主要原因。
10.
2014年，朱恩教授团队在新英格兰医学杂志上发表名为“Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia”的文章，证实anti-CD19CAR-T细胞可以用于治疗复发性ALL。该文章的通讯作者为费城儿童医院的Stephan Grupp医生。在该研究中，病人数量达到了30人，同时包括了儿童和成年人。病人经治疗后的完全缓解率达到了惊人的90%。
自2009年朱恩教授团队第一篇关于antiCD19CAR-T文章的发表，到2014年新英格兰医学杂志上文章的发表，短短5年时间，朱恩教授个人及其团队赢得了无数关注和期待，也让CAR-T技术在生物医药领域誉满全球。
值得注意的是，虽然朱恩教授使用的antiCD19scFv-41BB-CD3Zeta结构是由坎帕纳教授设计开发的，但是这之后坎帕纳教授并没能将其推到临床阶段，也没有后续工作开展。如果没有朱恩教授在顶住了无数压力的情况下坚定地将antiCD19CAR-T推到临床阶段，也许我们很多人现在还不知道CAR-T这项技术，也不会有CAR-T技术在临床上的成功，更不会有世界各地无数B系血液癌症病人的翘首以盼。
工欲善其事，必先利其器。如果要进行细胞免疫治疗的临床研究，尤其是CAR-T技术的研究开发，一个规范化、高效率和高水平的GMP细胞生产中心是必不可少的条件。宾夕法尼亚大学临床细胞和疫苗生产中心（Clinical cell and vaccine production facility，CVPF）是国际细胞治疗认证基金（Foundation of the Accreditation of Cellular Therapy，FACT，一个由国际细胞治疗学会和美国血液和骨髓移植学会合办的非营利机构，负责细胞治疗领域的检查和认证）认证的GMP机构。
CVPF始建于1996年，已有21年历史。CVPF是宾大开展生物新疗法I期和II期临床试验的核心机构。CVPF的具体职责包括：激活用于癌症治疗的转基因异体或自体免疫细胞；通过对临床样本的分析，来评估细胞和基因疗法的有效性；开发新的、更好的细胞体外扩增方法和转基因方法；让宾大的研究人员和合作者更好的认识临床试验相关政策法规；通过更广泛的应用CVPF在细胞治疗领域开发的新技术，提高新的细胞疗法的应用范围。
在细胞和基因疗法领域，CVPF向研究者开展的研究性新药申请（INDs）提供科学指导、技术支持和政策法规支持。在FDA 21 CFR Parts 210 and 211指导下，CVPF有能力对人体多种细胞进行体外处理，其中包括：源于骨髓的CD4+和CD8+T细胞、树突状细胞、骨髓基质细胞（间质干细胞）。CVPF对这些细胞进行的基本操作流程包括获得病人细胞，对这些细胞进行体外扩增和转基因等。CVPF目前正在开展的临床试验主要在下列疾病领域：血液癌症（myeloma、Leukemia和Lymphoma）、乳腺癌、神经系统肿瘤、宫颈癌、肺癌和HIV等。
中国很多医院和公司希望建成高水平的细胞治疗生产中心，但是找到合适的参考标准和模版并不容易。宾大CVPF有悠久的历史、独特的优势和丰富的临床实践和成功的经验，笔者认为CVPF是小规模生产I期和II期临床试验细胞材料很好的模版和效仿对象。
不仅是中国，在美国也有很多细胞免疫治疗企业在建设cGMP级细胞生产中心。他们有充足的资金和场地，唯独缺乏相关的管理人才和工作人员。因此，CVPF的管理人员和工作人员经常被高薪挖走。当然莱文教授是不愿意看见这种情况发生的。下面主要分五个方面：机构设置、仪器设备、服务内容、人员组成和申请使用来具体介绍宾大CVPF，希望能让读者对宾大CVPF有一个深入的了解。
CVPF包括三个独立的GMP生产工厂（现为两个）：Maloney、Ravdin和Center for Advanced CellularTherapies（CACT）。这三个工厂使用同一个Quality Control（QC）实验室和Quality Assurance（QA）单元。这两个单元是CVPF质量控制系统的核心。在完成全部质量控制环节后，由他们最终负责GMP产品的出厂。CVPF内部都为洁净级空间。每个CVPF工厂都配有The Air Handler Unit（AHU）。AHU向CVPF内部提供经过HEPA过滤装置过滤过的外部空气，使CVPF内部有稳定的空气流，保证洁净室内的洁净级别。
CVPF-Maloney （现已不属于CVPF）
CVPF-Maloney位于宾大医院Maloney楼的6楼。它于2005年开始运营，面积1880平方英尺（约174.66平方米）。截至2016年7月，除了进出CVPF-Maloney的换衣间，CVPF-Maloney拥有6个常用操作间和一个培养基制备间。其中两个操作间主要用于HIV相关产品制备。CVPF-Maloney洁净室级别属于class 100，000（ISO 8），对产品的处理在class100（ISO 5）的生物安全柜内进行。
CVPF-Ravdin
CVPF-Ravdin位于宾大医院Ravidin楼的3楼，面积2000平方英尺（约185.81平方米）。CVPF-Ravdin非常靠近血细胞采集和输入单元（Apheresis cell collection and infusion unit）、自体和异体献血中心（The autologousand allogeneic blood donor center）、血库（The blood bank）和干细胞处理中心（The stem cell processing facility）。除了进出的更衣间外，CVPF-Ravdin拥有7间操作间、一个培养基制备间和一个储物间。内部通道的洁净级别是class 100，000（ISO 8），操作间的洁净级别是class 10，000（ISO 7），对产品的处理在class 100（ISO 5）的生物安全柜内进行。
CVPF-CACT
CVPF-CACT于2016年7月才开始运营，面积为4500平方英尺（约418.06平方米）。它位于宾大新建的South Tower building的9楼，与宾大Smilow Translational Research Center毗邻。除了进出的更衣间外，CVPF-CACT拥有8个操作间、1个自动化操作间和1个培养基制备间。内部通道的洁净级别是class 100，000（ISO 8），操作间的洁净级别是class10，000（ISO 7），对产品的处理在class 100（ISO 5）的生物安全柜内进行。
CVPF CACT内景 / 图片来源：宾大CVPF网站
QC-实验室
CVPF-CACT还包括一个QC-实验室，这个实验室为CVPF的两个工厂提供服务。CVPF QC-实验室通过对包括培养基在内的关键试剂进行检测分析，确保研究性产品的扩大试验、检验和生产能够顺利进行。同时，QC实验室在产品生产过程中以及出厂前对产品进行一系列分析检验，其中包括使用流式细胞术进行样品分析、检测Mycoplasm和endotoxin以及无菌检测等。
CVPF质量控制计划
CVPF质量控制计划按照由国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy，ISCT)，美国血液和骨髓移植学会（The American Associationof Blood Bank，AABB)和国际细胞治疗认证基金（FACT）三者共同建立的标准设立的。该控制计划是一个包括质量评估QA（Quality Assessment）、QC和不断改进的整合项目，它监控了CVPF的所有工作环节，包括人员、设备、设施维护和生产加工程序等环节。该质量控制计划的主要目的是保证一致的生产过程，减少和控制生产过程中的不稳定因素，保证最终产品的质量。
GMP工厂关键设备的正常运作是正常生产的必备条件。CVPF的关键设备都由Rees Centron Environmental Monitoring System远程监控。Rees感受器每15分子记录一次参数，如果参数超出预设范围，它会发出警报。
CVPF两个工厂都由经过培训的员工按照既定程序定期做清洁。关键的细胞处理设备，在使用前和使用后都要做无菌清理。附属设备，在使用后需清理干净。常用的细胞处理仪器存放于洁净室中央地带，在使用时被移到细胞操作间。CVPF使用一次性的管路系统，以防止污染。在技术条件允许的情况下，CVPF一律使用封闭式系统进行细胞操作和其他操作。（详情见下表）
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主要设备名称
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功能
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Counterflow Centrifugation Elutriator
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PBMC提取，血细胞分离
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Haemonetics Cell Saver 5 Autologous Blood Recovery System
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细胞浓缩和清洗
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Miltenyi CliniMACS Magnetic Separator
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一体化细胞生产操作系统
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Baxter MaxSep Magnetic Separator
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去除CD3/CD28磁珠
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WAVE 2/10 Bioreactor
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摇袋式细胞培养反应器
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Wave 20/50 EHT Bioreactor
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摇袋式细胞培养反应器
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Coulter M3/M4 Cell Counter
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T细胞计数
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BACTEC© 9050 Blood Culturing System
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快速培养和检测血液微生物
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BACTEC© FX Blood Culture System
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快速培养和检测血液微生物
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Flow cytometer, BD LSR Fortessa/FACS Calibur
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流式细胞术分析
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CO
2
incubators and Lamina flow hood
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细胞培养
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Refrigerator, Freezer(-30/-40/-80) and LN2
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低温保存和冷冻保存
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Terumo Sterile Connect Device
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无菌连接装置
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REES monitoring system, server based
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系统监控
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Total Air Particle Counter
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环境颗粒物监控
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Auxiliary equipment
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其他常规辅助设备
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CAR-T细胞的生产流程 / 图片来源：宾大CVPF网站
CVPF主要向用户提供三个方面的服务：
1.
细胞处理服务。主要包括：对Pheresis产品的清洗和冷冻；在Pheresis产品中清除单核细胞；激活和扩增T细胞；使用逆转录病毒或者慢病毒转染激活的T细胞；非成熟和成熟的树突状细胞培养；从全血或者骨髓液中分离PBMC；从血浆中分离血清；构建并保存Master Cell Bank；Master Cell Bank的QC；将蛋白或抗体连接到磁珠上，以及产品QC；从实验室级别的规范（protocol）扩大到cGMP临床级别的规范（protocol）。
2.
咨询服务。
CVPF的负责人和员工为研究人员提供一对一的咨询服务。确保研究人员的临床试验能够顺利进行，同时还帮助研究人员申请经费以支持临床试验和向FDA提出IND申请。
3.
培训服务。
布鲁斯﹒莱文教授从1999年起到现在，一直担任CVPF的负责人。除CVPF总监莱文教授外，总监目前有6人，分别负责医学、科学、运营、设施、细胞生产和QA。经理4人，其中2人负责项目，1人负责QC，1人负责质量运营。
