经验分享|层析和超滤工艺过程中高蛋白浓度下的聚体形成过程

对生化试剂以及诊断、治疗用蛋白来讲，天然稳定的处方是必不可少的，从自然组织以及重组表达的宿主中提纯蛋白，柱层析和超滤是关键的工艺。理论上，结合在柱上的蛋白可以通过调节流动相的pH或添加剂的类型和浓度来被洗脱下来；而在超滤过程中，蛋白浓度随着体积的减少而线性增加，在这些工艺过程中，存在蛋白浓度或表面密度过高的情况，从而导致聚体形成以及蛋白的异质性。高蛋白浓度是注射型生物药品的主要挑战之一。在层析过程中，层析柱载量经常处于饱和状态，导致柱子表面蛋白密度高，甚至当柱子载量未达到饱和时，当样品从柱子一端开始上样时也会出现高蛋白密度的情况，这会引起蛋白在柱子进样侧达到局部饱和状态。超滤过程中也存在类似的情况，尤其在使用压力以及离心装置时，蛋白会在膜表面浓缩，从而造成浓度较高的状态。

对层析过程中出现的高蛋白浓度情况，可以通过批次结合实验来测试蛋白是否处于饱和状态，如果随机结合的蛋白不能形成聚体的话，那么高密度的结合就可能引起聚体形成。由于批次结合实验操作不方便，因此这并不是好的解决方法，不管怎样，还是需要通过柱层析来验证。在超滤过程中，使用不同的装置或膜是一种检测方法，之前的实验结果表明：在超滤过程中的蛋白溶液如果含有精氨酸能够显著抑制聚体的形成，在柱层析中，精氨酸也有类似的效果。文章中我们将描述高蛋白浓度以及高密度的背景知识，以及由此导致的一些问题。需要强调的是现在并没有高蛋白浓度引起的一些问题的综合性报道，但是也有一些研究的摘要，包括尚未发表的研究结果可以证明。

许多类型的层析方法被用于纯化蛋白，包括IEC、HIC、HA、复合型层析和亲和层析，比如ATP柱和protein A柱，这些层析通常有很高的配基密度，表现为蛋白载量高，例如每毫升填料结合50-100mg蛋白，如此高的蛋白结合量会导致在柱表面形成高的蛋白密度，正如高蛋白浓度会引起聚体一样，高蛋白密度一样会引起聚体形成，如果蛋白上样量小于填料载量，那么柱本身未饱和，高蛋白密度的情况会避免。

假设蛋白结合量低于饱和状态不会引起聚体形成，但是这个假设并不简单。尽管柱子并没有饱和，柱的顶部，也就是进样的地方会局部达到饱和的状态，当蛋白溶液垂直进入柱子的时候，蛋白会结合在柱子上部，当蛋白持续进样时，顶部会先达到饱和的状态，在这种饱和的状态下，蛋白会在填料表面形成单独的一层并且处于高密度状态，高密度的蛋白会引起的主要问题就是在洗脱过程中的蛋白解吸附和聚体形成，是否高密度会引起回收率降低以及聚体形成可以通过后续的批次结合试验来验证。

当进行IEC层析时，也发现当用NaCl来进行洗脱时，蛋白的构象发生了改变，也就是说，不论是在柱层析模式或是批次结合模式下，蛋白结合并不饱和但是比较强，这时出现了两个洗脱峰，第一峰鉴定为单体峰，第二个峰则是由于构象改变引起的，蛋白在层析过程中构象改变之前也被间接的证明过。当洗脱过程用精氨酸代替NaCl，那么双峰的现象就会消失。精氨酸主要降低蛋白分子间的结合力，在反相过程中也出现了双峰的情况。当在不饱和状态下结合比较强的话，柱上结合可能会导致蛋白构象的可逆变化。

批次结合并不运用于治疗性蛋白的生产，经常用于研究，其蛋白上样过程是在容器中将悬浮的填料与蛋白充分混匀，蛋白随机结合到填料上，这种方式不会引起填料局部饱和。成功的例子比如：a.单克隆抗体柱层析过程中由于局部密度高会导致形成白色的一层物质，进而引起聚体形成，而在将填料和蛋白提前孵育后再装柱，则大大降低了填料表面的蛋白密度；b.通过protein A层析亲和纯化Fc融合蛋白，需要洗脱pH低于3，同时蛋白易沉淀，而通过将填料与蛋白孵育后，洗脱pH可以更高同时也无沉淀，这表明高蛋白密度会导致聚体的形成，尽管这种批次结合实验不能用于产业化生产，但是可以用来纯化试剂用蛋白，因为其要求相对比较低。

当蛋白结合趋近饱和时，蛋白分子间的斥力和静电作用力会降低填料的结合载量，高度无盐的状态会克服排斥力并加强分子间的作用力，高分子量的PEG以及硫酸铵常用来沉淀蛋白，最近Gagnon开发的新型层析（SXC）是基于PEG的不解离性质，这对于运用PEG分离聚体有更好的应用，当在IEC或HA层析时添加PEG，蛋白的结合会更紧密，特别是聚体，因此它能更好的将单体和聚体区分开来，SXC用的填料不带配基，蛋白结合通常不存在，然而大分子蛋白如单克隆抗体在存在PEG的时候能结合，并在填料表面形成复杂的层，结合的蛋白通过降低PEG的浓度来洗脱。

  凝胶过滤（SEC）由于其本身的性质，因此不存在结合和高密度的现象，也就是说，填料的载量微乎其微，不过其所谓的结合是非特异性吸附，因此需要的填料面积大来更好的进行非特异性吸附，实际上，在脱盐过程中，柱顶部也会由于非特异性吸附而饱和，我们开发了流动相中含有精氨酸的方法可以用来:1.降低或消除非特异性吸附;2.提高脱盐过程回收率高;3. 精确计算抗体浓度;4.延长柱子的使用寿命。

精氨酸对抑制蛋白之间的相互作用非常有效，因此可以通过在样品中加精氨酸来抑制蛋白表面的相互作用，在纯化重组interleukin-2时，IEC层析用其他盐进行洗脱时发现会有不同程度的聚体，通过在样品中添加0.2-0.25 M乙酸钠后可以降低一半的聚体，但是回收率提升不明显，这是由于醋酸盐能够降低静电作用并因此降低柱顶部存在的局部饱和状态。此外，添加0.2 M精氨酸，聚体几乎降为0，这是由于添加精氨酸能够更加明显的降低蛋白之间的作用力。

HIC中也存在类似的高蛋白浓度的情况，在上样过程中加入精氨酸可以改善疏水结合力和聚体的形成，同时蛋白回收率也能够显著提高，然而，过高浓度的精氨酸会导致蛋白结合力的下降，精氨酸能够将柱层析过程中的样品分布情况破坏，其主要原因是精氨酸本身的解离性质以及静电作用力的下降。

在流动相中加入盐或精氨酸能够显著的改善层析性能，在金属亲和层析过程中，我们之前遇到过洗脱样品浑浊的现象，当载量较低时，没有出现该现象，而在放大后，载量接近10mg/ml时，浑浊现象出现，但是当在洗脱液中加入150 到300mM的盐时，该现象消失。

类似的聚体形成情况在亲和纯化重组抗原时也出现，当通过柱层析时，会形成白色的一层，而当批次结合实验时，该现象消失，然而即使通过批次结合实验，通过盐洗脱样品依然会浑浊，通过添加1 % CHAPS或0.5 M Arg后，浑浊消失。

在亲和层析中，通过在洗脱液中加入精氨酸可以提升蛋白回收率，降低聚体形成，为了更好的推动protein A的应用，我们致力于该研究，洗脱抗体或Fc融合蛋白主要通过低pH洗脱，这会造成局部结构改变进而引起聚体形成，而当加入精氨酸后，可以调高洗脱pH和回收率。

Fc融合蛋白通过Fc区与protein A结合，由于其非天然蛋白，因此更容易形成聚体，可以通过添加精氨酸来使得洗脱pH变得温和。

亲和层析对于纯化带标签的蛋白非常方便，如protein A，ATP，GTP，其游离的配基可以用于竞争洗脱，而通过精氨酸洗脱可以降低成本。

抗原亲和层析可以用于纯化抗原抗体结合蛋白，由于其特异性强，会导致蛋白出现高密度，柱层析过程中蛋白构象的改变可以通过加入精氨酸来改善，主要是由于精氨酸能够降低蛋白之间的结合力以及精氨酸簇的形成。

层析过程中蛋白浓度不是一直不变，传统的如超滤过程，超滤在治疗性蛋白以及试剂蛋白的纯化过程中是比较关键的步骤，用于替换缓冲液和浓缩。小规模的时候，水和小分子可以通过离心或压力的方式透过半透膜，蛋白浓度在膜表面浓度会变得很高，在抗体超滤过程中，尤其在低温过程超滤时，易出现浑浊现象，而加入精氨酸可以降低聚体的形成。

治疗性抗体由于需要高剂量，因此需要超滤至高浓度，高蛋白浓度会形成高粘度，而且需要更合适的处方，然而超滤过程中形成高蛋白浓度与小的亲水半径有关，甚至是2nm，在protein A层析低pH洗脱的时候也出现小的水合半径，只有溶菌酶的10倍小。这主要是由于处于低盐或pH下，静电作用不能完全被隔离，而在高蛋白浓度下，过量的体积占主要作用。

聚体问题也存在于大规模的细胞培养过程中（200L），主要是由于局部蛋白浓度过高以及压力大等原因。

高蛋白浓度以及高密度会引起聚体形成，将填料与样品孵育、加入添加剂如精氨酸可以降低或消除聚体的形成，主要是通过降低蛋白分子之间蛋白与填料表面的相互作用力。

参考文献：

Arakawa T, Ejima D, Akuta T. Protein aggregation under high concentration/density state during 

chromatographic and ultrafiltration processes. Int J Biol Macromol. 2017 Feb;95:1153-1158. 

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