在自然环境中，许多微生物无法单独存在，需要与其他微生物代谢互补相互依存共生，因此微生物研究面临很难找到合适共生菌进行培养试验的挑战。近年来关于宏基因组的文章不断涌现，
宏基因组对于展示微生物群落的多样性、分布和功能组成等方面起到重要作用，这也为后续挖掘共生菌进行共培养试验提供了思路与方向。
这里就以一篇基迪奥客户文章为例，给大家提供一个通过宏基因组挖掘共生菌进行共培养试验的新思路。宏基因组分析是本研究的出发点，通过宏基因组数据挖掘关键功能微生物，
通过丰度的相关性比较判定关键功能微生物间的共生关系，从而进行下一步的试验研究共生菌之间的相互作用
，
最后结合转录表达验证关键功能基因，一步步将故事讲清晰讲完整。接下来让我们一起看看文章的整体内容吧。
中文标题：
雨水中两种细菌促进土壤中甲基单胞菌的甲烷氧化
发表期刊：
Journal of Environmental Chemical Engineering
微生物甲烷利用在调节甲烷排放中发挥着重要作用，降雨会引起土壤水分、土壤有机质等土壤理化性质的剧烈波动，从而间接影响微生物群落，最终影响甲烷排放。先前的研究已经证明，甲烷氧化菌和异养菌的微生物相互作用有助于好氧甲烷氧化，但关于雨水微生物与好氧甲烷氧化菌互作可能会促进甲烷氧化这方面的综合研究还很有限。因此，本研究前期通过宏基因组数据挖掘功能微生物，进一步设计共培养试验揭示好氧甲烷氧化菌与雨水微生物相互作用的影响，并辅佐转录组阐明关键功能基因，有助于更好地理解雨水微生物如何影响湿地甲烷氧化。
（1）采集雨水样品、降雨前后的土壤样品进行宏基因组测序，分析并筛选功能微生物。
（2）设计共培养试验：将代表性甲烷氧化菌
Methylomonas sp. HYX-M1
分别与共生菌
Methylophilus sp. R2
或
Rhizobium sp. R1
进行共培养，分为纯培养、未灭菌土壤和灭菌土壤三个处理。将培养后的样品进行微生物群落结构和功能研究。
（3）验证甲烷氧化的相关功能基因表达。
分析降雨前后土壤中好氧甲烷氧化菌的群落结构，以确定潜在的甲烷氧化贡献者。结果表明，降雨前土壤中前五位的甲烷氧化菌主要为
Methylocystis
（18.5%）、
Methylocaldum
（11.3%）、
M
ethylocapsa
（10.6%）、
Methylomonas
（9.04%）、
Methylobacter
（8.6%）；而降雨后甲烷氧化菌类群基本不变，其中
Methylocystis
、
Methylosinus
和
Methylomonas
分别增加了19.60%、7.10% 和9.84%，说明雨水促进了这些甲烷氧化菌的生长。在降雨前后的土壤中，
Methylomonas
是第三丰富的好氧甲烷氧化菌，这在一定程度上代表了该地区好氧甲烷氧化菌的主要类群。此外，
我们还关注了雨水中能够促进甲烷氧化的活性微生物丰度的变化，
Methylophilus
的相对丰度从0.005%增加到0.024%，
Rhizobium
的相对丰度稳定在0.26%，这些结果表明促甲烷氧化活性菌与甲烷氧化菌存在协同作用。
图1 基于宏基因组对降雨前后土壤中好氧甲烷氧化菌群落组成进行分析，星号表示土壤中前五位的好氧甲烷氧化菌
首先通过宏基因组测序对雨水中微生物的物种组成进行初步的了解。在门水平上，雨水中前三的细菌类群为
Proteobacteria
、
Bacilli
、
Planctomycetia
；在属水平上，雨水中的细菌类群主要有
Enterobacter
、
Cronobacter
、
Bacillus
、
Klebsiella
、
Pseudomonas
、
Citrobacter
、
Serratia
、
Shinella
和
Stenotrophomonas
等。为了进一步从雨水中获得活性微生物，进行了富集培养。测序结果表明，富集后的微生物群落中门水平以
Proteobacteria
、
Deinococcota
为主要类群；而属水平上分离出了
Pseudomonas
、
D
einococcus
、
Serratia
、
Klebsiella
、
Enterobacter
、
Rhizobium
和
Methylophilus
这七个属。在本研究中
Rhizobium
和
Methylophilus
的相对丰度较低，通常在富集物中发现，可以作为甲烷氧化菌的合作者。本研究成功分离富集了
Methylophilus sp. R2
和
Rhizobium sp. R1
，表明这两种微生物在雨水中有活性。因此，当将雨水中很少检测到的活性微生物引入合适的环境时，它们有可能重新繁殖，可能会对降雨后的好氧甲烷氧化产生积极影响，即
Methylophilus sp. R2
和
Rhizobium sp. R1
可作为后续实验的代表性好氧甲烷氧化菌的共生菌。与此同时我们从雨水中分离富集了
Methylomonas sp. HYX-M1
，可作为后续实验的代表性好氧甲烷氧化菌。
图2 基于宏基因组的雨水微生物群落纲水平（a）和属水平（b）分析
为了进一步阐明甲烷氧化菌与其共生菌之间的互作关系，设计了共培养试验，将从雨水分离出来的
Methylomonas sp. HYX-M1
分别与
R
hizobium sp. R1
和
Methylophilus sp. R2
配对。结果显示，纯培养时，添加
Methylophilus
后甲烷消耗显著提高；而当
Rhizobium
的添加比例为1:1时，对24 h内的甲烷消耗均有显著促进作用，说明
Rhizobium
在显著提高好氧甲烷氧化中起关键作用。此外在降雨前分别向土壤中添加
Rhizobium
和
Methylophilus
，发现甲烷氧化速率分别提高了19.5%和27.9%，表明雨水中的微生物确实能促进土壤中的甲烷氧化。
对转录表达结果进行分析，结果显示与RuMP通路和钴胺素合成相关的基因（包括
hxl
、
pfkB
、
fba
、
cobA
和
cobC
）上调导致甲烷单加氧酶基因（
pmoA
和
mmoX
）和甲醇脱氢酶基因（
mxaK
和
mxaA
）的高表达，因此雨水中的活性微生物可以增强好氧甲烷氧化。
图4
Methylonomas
、
Methylophilus
和
Rhizobium
在土壤中的好氧甲烷氧化过程
本文从宏基因组测序结果出发，分析得出
Methylomonas
是土壤中好氧甲烷氧化的主要贡献者，
Methylophilus
和
Rhizobium
是促甲烷氧化活性菌，两者存在协同关系。进一步设计共培养试验，发现
Methylophilus
和
Rhizobium
的引入显著提高了好氧甲烷的氧化速率，结合转录表达验证甲烷氧化途径的相关基因表达，揭示了微生物互作改善好氧甲烷氧化的机制。
通过这样的思路，可以通过宏基因组挖掘更多的潜在共生微生物进行拓展研究，为共培养试验开拓方向。
