大家好！今天来了解一篇肌腱连接处（MTJ）的损伤修复研究——《Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction》发表于《SCIENCE ADVANCES》。大家知道，MTJ 对我们正常运动至关重要，可它一旦受伤，目前的治疗手段却不太理想，手术缝合和保守治疗都有局限，高复发率等问题让人头疼。这时候，组织工程策略就像是黑暗中的一道光。我们今天要讲的这项研究，就开发了一种生物活性纤维增强水凝胶，有望为 MTJ 损伤修复带来新的突破，让我们一起深入了解一下。
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一、研究背景与意义
肌腱连接处（MTJ）是连接肌肉和肌腱的复杂组织，在力传递中起关键作用，但易因重复性负荷而受伤。目前临床治疗方法如保守治疗和手术缝合存在局限性，如瘢痕组织形成、缝合处断裂和大缺损修复困难等，导致复发率高。组织工程策略为MTJ修复带来希望，但现有研究有限且缺乏体内功能评估。本研究旨在开发一种能提供机械支持和优化微环境的生物活性纤维增强水凝胶，以促进MTJ的结构和功能再生。
二、生物活性纤维增强水凝胶的制备与表征
（一）制备方法
采用熔融沉积建模（FDM）3D打印技术制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架，将丝素蛋白甲基丙烯酰基（SilMA）前体、间充质干细胞（MSCs）和重组Klotho混合液融入支架，经光交联形成纤维增强水凝胶。
（二）结构与性能表征
1、微观结构
扫描电镜（SEM）图像显示SilMA水凝胶渗入PLGA支架孔隙，为细胞黏附提供有利微环境。PLGA、SilMA-PLGA和Klotho@SilMA-PLGA（K@SM-PA）支架的PLGA纤维直径相似，约为340μm。SilMA-PLGA和K@SM-PA支架的孔隙面积无显著差异，表明添加Klotho对SilMA水凝胶微孔结构影响不大。
2、力学性能
力学测试表明纤维增强水凝胶的拉伸模量高于大鼠天然MTJ组织，且各支架组的失效力均大于20N，说明该水凝胶能为受伤的MTJ提供足够机械支持。
3、流变性能
流变测试显示添加Klotho未改变SilMA水凝胶线性粘弹性区域长度，且在0.1-100rad/s频率范围内，两种水凝胶的储能模量（G
′
）均高于损耗模量（G
″
），表明形成了稳定水凝胶。但K@SM水凝胶的储能模量略有下降，可能是Klotho蛋白与SilMA链相互作用导致双键断裂和结合效率降低。
4、降解与亲水性能
选择LA/GA比为75:25的PLGA以实现缓慢降解，K@SM-PA水凝胶在模拟生理环境中呈现快速-缓慢的双相降解模式，这归因于SilMA水凝胶的快速降解和PLGA纤维的逐渐降解。
同时，SilMA水凝胶的引入显著提高了PLGA支架的亲水性和溶胀比，且Klotho对纤维增强水凝胶的亲水性无显著影响。
5、细胞相容性
细胞相容性实验显示，在SilMA-PLGA（SM-PA）和K@SM-PA水凝胶中培养3天的MSCs，大部分细胞存活，存活率超过80%，且细胞增殖正常，表明该水凝胶具有良好的细胞相容性。
三、生物活性纤维增强水凝胶对大鼠MTJ再生的影响
（一）实验模型与分组
构建大鼠MTJ缺损模型，将实验动物分为对照组（Ctrl）、SM-PA组、MSCs@SilMA-PLGA（M@SM-PA）组和Klotho/MSCs@SilMA-PLGA（K/M@SM-PA）组。
（二）结构再生评估
1、组织学染色
术后4周，H&E和Masson三色染色显示，K/M@SM-PA组再生的MTJ组织中肌肉和肌腱纤维插入广泛且交错明显，而Ctrl和SM-PA组则少见、不规则且短交错。K/M@SM-PA组形成更有序的肌腱纤维，且有类似天然波浪状的肌腱胶原纤维。
定量分析表明K/M@SM-PA组的肌腱组织学评分更低，肌肉纤维直径更大。
2、免疫组化染色
免疫组化染色检测Paxillin（图2D、I）、TNMD（图2E、J）和MYH4（图2F、K）等组织特异性蛋白表达。结果显示K/M@SM-PA组的Paxillin染色强度最高，表明其促进MTJ形成的能力最强；TNMD表达显著增加，提示促进了成熟肌腱组织形成；肌肉纤维中MYH4染色更强，表明其有效促进了肌肉再生。
（三）功能恢复评估
1、步态分析
利用CatWalkXT系统进行步态分析，检测大鼠行走时的步长、摆动时间、摆动速度、强度参数等。术后1周，所有组大鼠步态均异常，但从第1周到第4周，K/M@SM-PA组的这些参数逐渐恢复并接近甚至超过正常大鼠，如术后2周，该组步长和摆动速度显著高于Ctrl组，且术后2周摆动时间最短，术后4周强度参数最高，表明该水凝胶显著改善了MTJ的功能恢复。
2、力学测试
术后4周对修复后的MTJ进行力学测试，发现K/M@SM-PA组的抗拉模量显著高于Ctrl、SM-PA和M@SM-PA组，虽仍弱于天然MTJ，但表明该水凝胶支持了MTJ在力传递方面的生理功能，有助于改善大鼠行走运动。
四、生物活性纤维增强水凝胶促进MTJ再生的机制
（一）体内蛋白质组学分析
1、差异表达蛋白筛选
对术后2周的M@SM-PA和K/M@SM-PA组再生MTJ组织进行体内无标记蛋白质组学分析，鉴定出937种蛋白质，其中K/M@SM-PA组相对于M@SM-PA组有193种蛋白质上调，553种下调。
2、功能富集分析
上调的差异表达蛋白（DEPs）富集于与骨骼肌发育和功能维护相关的生物过程（如“肌肉系统过程”“骨骼肌收缩”等）、细胞组分（如“肌球蛋白复合物”“锚定连接”等）和分子功能（如“肌肉α-肌动蛋白结合”），表明Klotho促进了骨骼肌再生。
下调的DEPs与氧化应激（如“H₂O₂代谢过程”“细胞对H₂O₂/超氧化物/氧自由基的反应”等）和炎症反应（如“急性炎症反应”“炎症反应”等）相关，还涉及细胞死亡相关过程，表明该水凝胶可减轻MTJ损伤后的氧化应激和炎症反应，保护细胞免受氧化应激诱导的死亡，促进MTJ再生。
同时，上调的DEPs还显示对肌肉细胞发育和分化有积极调节作用，可能有助于维持干细胞功能表型。
（二）对移植MSCs的影响
1、细胞氧化应激调节
体外实验中，用H₂O₂和IL-1β刺激MSCs模拟受伤MTJ的病理环境，2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测定和定量聚合酶链反应（qPCR）检测表明，含Klotho的纤维增强水凝胶能显著降低MSCs内ROS水平，减少抗氧化酶表达，有效清除病理微环境中的ROS。
2、细胞存活与分化支持
该水凝胶能提高氧化应激下MSCs的存活率，体内实验中，K/M@SM-PA组植入7天后，存活的MSCs数量显著多于M@SM-PA组。
此外，在分化培养基中，该水凝胶支持MSCs向腱细胞和肌细胞分化，表现为相关标记物表达增加，且在IL-1β刺激的病理微环境下，能部分挽救MSCs受损的分化能力。
