作为一种老药，是否具有基础研究价值呢？是不是除了多中心临床研究外，很难发到高分杂志呢？来自海南省人民医院、武汉大学人民医院、首都医科大学宣武医院等团队的学者对于这一问题给出了答案：老药同样具有很高的基础研究价值，特别是当老药发现新功能，并挖掘出新机制的时候，一切都将变得有趣起来。如果大家有基金申请或者课题思路上的疑问，可以联系我们进行咨询：
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本期就让我们一起由这篇发表在Cell Reports Medicine杂志上的文章：The SGLT2 inhibitor dapagliflozin ameliorates renal fibrosis in hyperuricemic nephropathy. 一起看看，如何能把老药做新，我们又是否可以模仿？
本文研究了SGLT2抑制剂达格列净（主角药物）通过靶向ERRα调节OAT1轴（信号轴），增强尿酸排泄，从而改善高尿酸血症肾病（HN）中的肾纤维化和肾功能（临床问题），突出了ERRα-OAT1轴在治疗HN中的潜在价值。
1、为何关注SGLT2抑制剂达格列净与HN中的肾纤维化？本文的临床意义是什么？
临床的困境：HN是一种与尿酸代谢紊乱相关的肾脏疾病，其特征是肾小管间质纤维化和肾功能减退。肾纤维化是慢性肾病进展的关键病理过程，减缓肾纤维化对于阻止或逆转肾功能衰竭至关重要。
全新靶点与老药新用：虽然达格列净最初是作为糖尿病治疗药物开发的，但这项研究扩展了其在非糖尿病肾病，特别是HN中的潜在应用，为临床医生提供了更多的治疗选项。全新的治疗作用，意味着全新的机制，研究成功证实了ERRα-OAT1轴在HN发病机制中的作用，为未来的药物开发和治疗提供了新的分子靶点。
2、为何选择SGLT2抑制剂达格列净作为主角药物进行研究，依据是什么？如何进行证实？
文章发现达格列净治疗的患者肾脏组织学检查显示肾小管损伤减轻，同时血清肌酐和血尿素氮水平下降，免疫荧光染色观察到治疗组能够降低肾纤维化标志物，如aSMA和FN1。同样的，研究者在动物模型中也得到了一致结果。
3、文章进一步拔高的关键在于机制，其中通路的首个分子ERRα，是如何被发现的？
为了探索机制，研究者对HN患者和动物模型的肾脏组织进行Bulk RNA-seq，发现ERRα是一个在HN中表达下调的转录因子。研究者通过文献调研也发现ERRα在代谢过程中发挥作用，且与肾脏疾病有关（ps：测序+文献调研关键分子是很多article研究机制的套路）。
下一步最关键的就是：关键分子ERRα的正反验证。研究者发现在ERRα被敲除的细胞系中，达格列净的使用也无法阻止纤维化标志物的持续上调、ROS的过度产生、线粒体的碎片化，以及OCR和ATP的减少。而ERRα过表达的HN小鼠在尿酸、肾功能、纤维化指标上，却表现的很好。
4、既然起始分子找到了，那么又是如何找到ERRα的下游靶点的呢？
事实上，这一部分的内容，先行军就是生信分析，研究者通过富集分析探索了ERRα可能调控的生物学过程和通路，又使用了JASPAR数据库预测ERRα的结合基序，并在OAT1基因的启动子区域寻找这些基序。
但是光光生信的分析结果又不solid，验证方面研究者怎么做呢？
通过ChIP-seq检测了ERRα蛋白在OAT1基因上的结合情况，并验证了OAT1是ERRα的直接靶点。
双荧光素酶报告基因分析：构建含有OAT1基因启动子区域的野生型（WT）和突变型（MUT）报告基因载体，通过双荧光素酶报告基因分析，研究者评估了ERRα对OAT1启动子活性的影响。
分子对接模拟：使用分子对接软件，如AutoDock Vina，研究者模拟了ERRα蛋白与OAT1基因启动子区域的结合模式，进一步证实了它们之间的相互作用。
体内外实验验证：在体内（如ERRαptKI小鼠模型）和体外（如HK-2细胞）实验中，研究者验证了ERRα过表达或敲除对OAT1表达和功能的影响。
由分子对接层面，到细胞、动物分子互相影响的层面，逐一验证，这类验证思路也值得大家好好学习。而本文从临床现象，到机制的挖掘也是一气呵成，看的小编也是酣畅淋漓，不得不感慨高分文章其故事讲的圆满，引人入胜。
本文在机制这一块，所用的关键技术较为密集：
利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）确定ERRα转录因子在基因组上的结合位点
采用双荧光素酶报告基因分析探究ERRα对OAT1基因启动子活性的影响
细胞热位移分析（CETSA）来评估药物对细胞活性和蛋白质稳定性的影响
分子对接模拟、表面等离子共振（SPR）和微量热泳动（MST）分析来预测和测量药物与靶蛋白之间的相互作用
老药新用，深挖机制：传统上，达格列净被用于治疗2型糖尿病，主要通过抑制肾脏中的SGLT2来减少葡萄糖的重吸收。然而，本文揭示了达格列净通过靶向转录因子ERRα，进而调节尿酸转运蛋白OAT1的活性，这一机制在HN的治疗中具有潜在的应用价值。
ERRα-OAT1轴的调控关系：本文通过ChIP-seq分析，确定了ERRα在OAT1基因启动子上的结合位点；并通过双荧光素酶报告基因分析等验证了ERRα对OAT1启动子活性的正向调控作用。一系列实验验证使得这一条机制通路的证据十分solid。
事实上，这一研究思路并非本文独有，不妨让我们来看下面这篇文章：SGLT2 inhibitor dapagliflozin reduces endothelial dysfunction and microvascular damage during cardiac ischemia/reperfusion injury through normalizing the XO-SERCA2-CaMKII-coffilin pathways.
这篇文章同样是达格列净这一药物，而研究者想解决的问题：该药是否有保护心脏微血管内皮细胞免受缺血/再灌注损伤（IRI）的作用（全新功能的探索）？并探讨其分子机制。
两篇文章思路上可以类比，达格列净作为一种SGLT2抑制剂，在糖尿病治疗中显示出心血管保护作用，此文中研究的问题就是：格列净可能通过影响特定的信号通路，对心脏微血管具有保护作用。
进一步，研究者利用小鼠IRI模型（类比HN小鼠模型），评估DAPA对心脏微血管结构和功能的影响。同时利用人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）的缺氧/再灌注（H/R）模型（类似HN患者），研究DAPA对内皮细胞功能的影响。
文章的最终结论同样地类似：达格列净（同一种药物）通过抑制XO-SERCA2-CaMKII-cofilin信号通路（机制通路），有效减少心脏微血管损伤和内皮细胞功能障碍（细胞靶点），为心脏IRI（临床问题）提供了新的治疗策略。
