在国自然的研究内容中,蛋白-蛋白互作是几乎所有项目都会涉及的,下面我们就列举和梳理10种技术:酵母双杂交系统(Y2H)、免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down、免疫荧光(IF)共定位、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量转移(FRET)、邻近连接技术(PLA)、双分子荧光互补(BiFC)、等温滴定量热分析(ITC)和双电子-电子共振光谱(DEER)。
在介绍这些技术之前,一定要把最重要的注意事项说明:
1.除了这些湿实验方法以外,还有干实验的方法策略:像AlphaFold、分子对接等也能让蛋白-蛋白互作结果更可信,因此一般也需要;
2.在这些技术中,有的技术适合筛选靶蛋白(如酵母双杂交Y2H),有的技术适合验证蛋白互作(如邻近连接技术PLA),也有的技术既适合筛选靶蛋白,也适合验证蛋白-蛋白互作(如免疫共沉淀Co-IP+蛋白质谱就可以筛选、+WB就可以验证;如表面等离子共振SPR)。因此一般筛选的技术放在预实验中用于确定研究靶点,而验证的技术多用于确定具体分子后使用;
3.这些技术方法既有基于细胞体系,又有非细胞体系的(In tube),细胞体系的方法更能体现研究背景的重要性,但干预因素比较多;而非细胞体系则更容易验证直接互作,但未必能反映研究背景,而且前面蛋白纯化操作要求更多,因此要验证蛋白-蛋白互作,需要在“细胞+非细胞体系”都验证方才严谨;
4.这些技术方法的原理和检测手段多样,需要注意的是:每个方法都有一定的优势和缺陷,因此一般都需要通过多种方法来验证,而且最好是不同的形式,如“分子对接+Co-IP的质谱和WB条带+免疫荧光共定位(Confocal)+SPR方法等”,这样专家更认可。需要注意的是:细胞体系的Co-IP并不能完全确定蛋白A和蛋白B的直接结合(即排除C介导A与B的结合),A蛋白与B蛋白共定位也只能作为A与B互作的支持证据。另外,蛋白-蛋白互作是“定性”描述,因此其它“定量”的结果证据性更强。
5.下面的方法中,有些技术是必须的,有的是可以加分的(个人观点)。虽然技术多,但不用全部都放上去。
一、酵母双杂交系统(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)☆☆☆,主要用于筛选与目的蛋白结合的靶蛋白(国自然可选)真核生物的转录激活因子通常包含两个独立的结构域:DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)。这两个域单独存在时不能激活转录,但当它们在空间上靠近时,可以重新组成有活性的转录激活因子,激活下游基因的转录。
操作步骤如下:
1. 将感兴趣的蛋白(蛋白X)与BD构建融合蛋白(诱饵),将待测试的蛋白(蛋白Y)与AD构建融合蛋白(猎物)。
2. 将这两个融合蛋白的基因分别转入酵母细胞中。
3. 如果蛋白X和蛋白Y在酵母细胞内相互作用,它们的融合蛋白将BD和AD拉近,形成有活性的转录激活因子。
4. 激活的转录激活因子将驱动报告基因(如HIS3、lacZ等)的表达,通过检测报告基因的活性来判断蛋白间是否存在相互作用。
二、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)☆☆☆,既可用于靶蛋白筛选,也可用于验证蛋白-蛋白互作(国自然必需)
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,
Co-IP)的原理是基于抗体与抗原之间的专一性相互作用,用于研究蛋白之间的相互作用。当细胞在非变性条件下裂解时,蛋白间的相互作用得以保留。利用特定抗体沉淀目标蛋白,任何与之相互作用的蛋白也会一并沉淀。
操作步骤如下:
1. 收集细胞并裂解,裂解液中通常含有蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。
2. 细胞裂解后,离心去除细胞碎片,取上清液。
3. 加入特定抗体与蛋白A或G偶联的珠子,4°C下孵育使抗体与目标蛋白结合。
4. 孵育后,通过离心收集珠子,去除未结合的蛋白。
5. 用裂解缓冲液洗涤珠子数次以去除非特异性结合的蛋白。
6. 最后,加入样品缓冲液煮沸珠子以释放结合的蛋白复合物。
7. 通过SDS-PAGE电泳分离蛋白,再利用Western blotting或质谱仪进行分析。
☆☆☆,既可用于靶蛋白筛选,也可用于验证蛋白-蛋白互作(国自然一般必需)GST pull-down的原理是利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)与谷胱甘肽(GSH)之间的高亲和力,将GST融合蛋白固定在谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上,作为“诱饵”,用于捕获与之相互作用的“捕获蛋白”。此方法常用于体外检测蛋白相互作用。
1. 构建含有GST标签的融合蛋白表达载体,并在原核或真核表达系统中表达。2. 收集细胞裂解物,裂解液中通常含有蛋白酶抑制剂。3. 将裂解物与固定有GST或GST融合蛋白的琼脂糖珠混合,在4°C下孵育数小时。5. 用适当的缓冲液洗涤珠子,去除非特异性结合的蛋白。6. 加入样品缓冲液煮沸珠子,洗脱结合的蛋白复合物。7. 利用SDS-PAGE电泳分离蛋白,并通过Western blot或质谱分析鉴定互作蛋白。
四、免疫荧光共定位(ImmunoFluorescence Colocalization)☆☆☆,通过共同定位支持蛋白-蛋白互作(国自然一般必需)荧光共定位(Fluorescence
Colocalization)是一种用于研究蛋白在细胞内相互作用的技术。它通过使用两种不同颜色的荧光标签(如绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白DsRed)标记两种蛋白,然后在荧光显微镜下观察它们是否在同一位置表达。1. 将目标蛋白基因与不同的荧光蛋白基因融合,转染细胞。5. 图像分析,计算共定位系数以定量评估共定位程度。五、表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)☆☆☆☆,既可用于靶蛋白筛选,也可用于验证蛋白-蛋白互作(可加分)表面等离子共振(SPR)是一种实时监测生物分子间相互作用的技术,其原理基于光的全内反射现象。当特定角度的光入射到金属薄膜(通常是金膜)上时,金属中的自由电子与光波相互作用产生共振,导致特定角度(SPR角)的反射光强度显著降低。这种共振状态对金属薄膜附近的介质折射率变化非常敏感,因此当有分子结合到金属表面时,会改变局部折射率,从而引起SPR角的变化。通过监测这种角度变化,可以实时跟踪分子间的结合和解离过程。
操作步骤如下:
1. 将一种分子(通常是蛋白或抗体)固定在传感器芯片表面。
2. 将含有另一种分子的溶液流过芯片表面。
3. 使用SPR检测器实时监测结合过程。
4. 数据分析软件处理实验数据,提供分子间相互作用的动力学参数。
5. 使用适当的溶液再生芯片表面,以便进行下一轮分析。
荧光共振能量转移(Fluorescence
Resonance Energy Transfer, FRET)是一种基于荧光的非放射性技术,用于研究分子之间的相互作用和距离变化。FRET技术基于两个荧光分子——供体(Donor)和受体(Acceptor)之间的能量转移。当供体分子被激发时,它会发出光子,如果受体分子在空间上足够接近(通常在1-10纳米范围内),这些光子可以非辐射地将能量转移给受体分子,导致供体的荧光强度降低,而受体的荧光强度增加。FRET技术可以在活细胞内进行,无需标记,具有很高的灵敏度和特异性。
操作步骤如下:
1. 构建融合蛋白:将目标蛋白与供体荧光蛋白(如CFP)和受体荧光蛋白(如YFP)融合,构建重组表达载体。
2. 转染细胞:将构建好的载体转染到细胞中,使细胞表达融合蛋白。
3. 激发和检测:使用供体的激发光激发供体荧光蛋白,通过荧光显微镜或流式细胞仪检测供体和受体的荧光信号。
4. 数据分析:通过比较供体单独存在时的荧光强度与供体和受体共同存在时的荧光强度,计算FRET效率,从而推断蛋白间相互作用的情况。邻近连接技术(Proximity
Ligation Assay,PLA)是一种用于检测和定量蛋白相互作用、蛋白表达及其翻译后修饰(如磷酸化、乙酰化和糖基化)的技术。PLA技术通过使用一对带有寡核苷酸标签的抗体(PLA探针),当这些抗体与目标蛋白结合时,如果蛋白间存在相互作用,它们之间的距离会足够近,使得连接寡核苷酸能够连接这些PLA探针,并通过连接酶形成闭环的DNA模板,之后利用滚环扩增(RCA)进行信号放大,最终通过荧光或显色方式进行可视化检测。3. 一抗孵育:使用两种特异性抗体(一抗)分别与目标蛋白的不同表位结合。4. PLA探针孵育:加入两种PLA探针(带有寡核苷酸标签的二抗),与一抗结合。5. 连接反应:当两个PLA探针足够靠近时(表明它们的目标蛋白相互作用),通过连接酶连接探针上的寡核苷酸,形成DNA环。6. 滚环扩增:使用滚环扩增技术(RCA)放大信号,生成大量DNA副本。7. 检测:加入荧光标记的探针,与扩增的DNA结合,通过荧光显微镜进行可视化检测和定量分析。八、双分子荧光互补(BiFC)
☆☆☆☆,一般用于验证蛋白-蛋白互作(可加分)
双分子荧光互补(BiFC)技术的原理基于将一个荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)分割成两个不发光的片段,并将这些片段分别与两个潜在的相互作用蛋白融合。当这两个融合蛋白在细胞中共表达并相互作用时,它们将荧光蛋白的两个片段拉近到足够近的距离,使得这两个片段能够互补并重新折叠成完整的、具有荧光活性的荧光蛋白结构。这种荧光的恢复表明了目标蛋白之间的相互作用,允许在活细胞中实时观察蛋白相互作用的发生。
1. 构建载体:将荧光蛋白分成两个不发光的片段,并分别与目标蛋白的编码序列融合,构建成两个独立的表达载体。2. 共转染:将这两个载体共转染到细胞中,使细胞同时表达两种融合蛋白。3. 蛋白相互作用:当目标蛋白通过相互作用靠近时,荧光蛋白片段也相互靠近并互补,形成完整的荧光蛋白。4. 荧光检测:通过荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞中的荧光信号,从而判断目标蛋白是否发生相互作用。等温滴定量热分析(Isothermal
Titration Calorimetry, ITC)是一种用于研究生物分子相互作用的热力学技术。它通过测量在恒定温度下,溶液中分子相互作用时释放或吸收的热量变化来获取分子结合的热力学参数。在ITC实验中,一种分子(通常是受体或靶标分子)被放置在滴定池中,而另一种分子(配体)则通过计算机控制的注射器逐渐加入。每次配体注射后,系统都会达到热平衡,然后测量由分子相互作用引起的热量变化。通过分析这些热量变化与配体浓度的关系,可以计算出分子间的结合亲和力和热力学参数,如结合常数(Ka)、结合焓(ΔH)、结合熵(ΔS)和结合自由能(ΔG)。1. 样品准备:将受体分子溶解在滴定池中,配体分子溶解在注射器中。2. 基线校正:在没有受体分子的情况下,进行空白注射,以校正基线。3. 滴定实验:逐渐向受体溶液中注射配体溶液,每次注射后等待系统达到热平衡,然后记录热量变化。4. 数据分析:通过分析热量变化与配体浓度的关系,使用ITC软件计算出结合常数、结合焓、结合熵和结合自由能。5. 曲线拟合:将实验数据拟合到适当的结合模型,如一对一结合、一对多结合等。双电子-电子共振光谱(Double Electron-Electron Resonance Spectroscopy, DEER)是一种高灵敏度的脉冲电子顺磁共振(EPR)技术,用于测量生物分子内部或分子间的距离。DEER通过自旋标记技术,可以在纳米级精度上研究生物大分子的结构和动态。在DEER实验中,首先将含有未成对电子的自由基(自旋标记)附着在生物分子的特定位置。然后,通过一系列微波脉冲激发样品中的自旋标记,并在可变的延迟时间后,施加另一个微波脉冲来检测自旋标记的信号。通过分析不同延迟时间下的信号变化,可以推断出自旋标记之间的距离。1. 样品准备:将含有自旋标记的生物分子样品制备好,并确保其处于适当的状态(如冷冻状态)。2. 仪器设置:调整EPR仪器以进行DEER测量,包括微波频率、脉冲宽度、脉冲间隔等参数。3. 数据采集:进行DEER实验,记录不同延迟时间下的EPR信号。4. 数据处理:使用专门的软件分析EPR信号,提取自旋标记之间的距离信息。5. 结构分析:根据测量的距离信息,结合已知的分子结构,构建或验证生物分子的三维结构。
如果大家有基金申请或者课题思路上的疑问,可以联系我们进行咨询:推荐阅读: