内体途径中，货物的降解、回收再循环以及细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）产生和分泌过程涉及膜重塑与货物分选【1-3】。多囊泡内体（multivesicular endosomes，MVEs）中腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）的形成对于后续货物的降解以及出细胞成为EV，例如外泌体，具有重要意义（详见BioArt报道：专家点评Cell Research丨康铁邦团队发现新的外泌体通路 ）。构成ILVs的蛋白和脂质影响外泌体的功能，因此ILVs的货物分选十分重要。虽然蛋白质的分选已经被广泛研究【1】，但脂质分选仍然知之甚少。CD63是一种主要定位于MVEs、ILVs和溶酶体的四次跨膜蛋白【4,5】。由于在外泌体中富集，CD63常用来作为外泌体的可靠标记物【5】。既往研究发现CD63的功能与细胞类型相关，但CD63的通用功能较少研究。近日，法国巴黎文理研究大学居里研究院Guillaume van Niel研究团队在Nature Cell Biology杂志在线发表题为CD63 sorts cholesterol into endosomes for storage and distribution via exosomes的研究文章。该研究发现CD63分选胆固醇进入内体腔内囊泡形成短暂储存池，可以被NPC1/2介导回收或进入外泌体递送至受体细胞，为细胞胆固醇储存、转运和递送提供新的理解。团队通过CRISPR/CAS9方法在Hela和MNT-1中分别构建CD63敲除细胞系，发现CD63的敲除并不影响内体和溶酶体腔室定位、ILV含量以及小EV（small EVs，sEVs）的分泌和大小分布。siRNA介导的CD63敲减也获得相同的结果，排除长期敲除引起的可能代偿。定量质谱发现，对于膜蛋白，CD63敲除引起极少量蛋白变化；对于EV，CD63敲除引起Hela来源sEVs的MMP12和BASP1的降低和MNT-1来源sEVs的VGF和LGALS3BP的降低。总之，这些数据表明CD63敲除既不影响sEVs释放也不影响sEVs蛋白的改变。随后，作者分析CD63对脂质稳态的影响。脂质组学分析发现sEVs主要包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、缩醛磷脂-PE（PE-P）、鞘磷脂（SM）和游离胆固醇（FC）。和整个细胞相比，HeLa细胞来源sEVs富集FC、胆固醇酯（CE）、SM和PE-P，但缺少单酰基甘油磷酸盐（BMP）、磷脂酰肌醇（PI）、PC、溶血磷脂酰甘油（LPG）和磷脂酸（PA）；类似的，MNT-1细胞来源sEVs富集FC、CE、SM和溶血磷脂酰胆碱（LPC）而缺少BMP、PC、PE、PI、磷脂酰甘油（PG）和LPG。显然，两种细胞sEVs均富集FC、CE和SM，表明可能存在一种主动分选机制。对细胞而言，CD63敲除引起HeLa细胞FC、PE-P和神经酰胺（CE）的轻微下降以及MNT-1细胞PE的增加；对sEVs而言，CD63敲除引起HeLa来源sEVs LPG的降低，MNT-1细胞来源sEVs CE的增加以及FC、BMP、LPE和PE-P的降低。总体来说，CD63敲除轻微调节细胞胆固醇稳态。随后，作者探究CD63对胆固醇的转运调节。CD63敲除并不影响细胞对外源胆固醇的摄入和处理。使用产气荚膜梭菌溶血素O的D4片段融合GFP（D4-GFP）对胆固醇染色发现，无论是否有U18666A（NPC1抑制剂）处理，CD63敲除都不影响有外源胆固醇补充时的细胞胆固醇分布。当移除外源性胆固醇同时给予U18666A处理时，WT细胞胆固醇富集并与CD63共定位，表明CD63+结构是胞内内源性胆固醇主要分布位置。与此同时，透射电镜表明CD63+结构为ILVs。CD63敲除则显著降低胆固醇的含量，表明IVLs内胆固醇降低。这些结果表明CD63在ILVs产生短暂的可以被NPC1回收的胆固醇储存池。有意思的是，在这种情况下，高尔基体的胆固醇增加，提示胆固醇进入ILVs前转运至高尔基体。后续研究发现CD63敲除刺激由Arp2/3-依赖的肌动蛋白聚合介导的从内体向高尔基体的逆向运输，进而诱导胆固醇从内体转运到高尔基体。最近的研究指出CD81具有胆固醇结合口袋【6】。因此，团队构建CD63的三维模型，发现CD63和CD81有类似的二级拓扑结构，均具有锥形结构和膜内腔。序列匹配揭示类似于CD81的219位谷氨酸残基（E219，和胆固醇羟基基团结合），CD63第四次跨膜结构域的217位也是谷氨酸残基（E217）。在CD63敲除细胞补救实验中，D4-GFP染色证实E217突变为谷氨酰胺可以减弱CD63过表达介导的IVLs内胆固醇水平恢复。这些结果证实CD63在内体中的胆固醇转运能力。考虑到ILVs对于外泌体形成的重要作用，团队检测CD63敲除细胞分泌sEVs中胆固醇水平。在无外源胆固醇培养条件下，CD63敲除细胞来源的sEVs的胆固醇显著降低。这种胆固醇的减少导致sEVs的生物物理性状发生改变，例如膜硬度。由于sEVs可以被临近或其他部位细胞吸收，作者发现正常细胞对WT细胞和CD63敲除细胞来源sEVs具有相似的吸收率。尽管如此，由于降低的胆固醇水平，摄入CD63敲除来源sEVs的受体细胞接受胆固醇含量也降低。这些结果表明缺乏胆固醇的sEVs并不影响受体细胞摄入，但降低其胆固醇递送能力。综上所述，这项研究发现内体CD63的胆固醇分选机制，即进入内体的胆固醇形成短暂的储存池，可以经NPC1/2回收或经细胞外囊泡递送到其他细胞，为细胞胆固醇代谢提供新的见解。https://doi.org/10.1038/s41556-024-01432-9制版人：十一
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