母体疾病和死亡率持续上升，妊娠高血压是这一问题的重要驱动因素。然而，评估潜在病理生理特征的能力在临床表现之前仍难以实现，使得识别高风险妊娠变得复杂。在 Nature 发表的题为《RNA profiles reveal signatures of future health and disease in pregnancy 》的论文中，研究者基于来自八个独立前瞻性收集的队列的综合转录组数据，涵盖 1,840 例种族多样的妊娠病例，展示了游离细胞 RNA（cfRNA）在揭示正常妊娠进展模式及在临床表现前几个月评估发展妊娠高血压风险的能力。
随着 NGS 技术的普及和推广，很多科研人都已经比较了解甚至做过转录组建库测序实验。但转录组建库真的简单吗？总会有这样的问题：
我的样本是 FFPE 样本，但保存时间有点久，质量很差，降解特别严重，能建库吗？
我的样本是血浆样本，RNA 提取量真的太少了，加上还要去除 rRNA，能建库吗？
我的样本是游离 RNA，做外泌体分析，这种特殊样本，这能建库吗？
我的样本，我的样本![]()
想要解决以上问题，首先需要从源头把控，选择合适的核酸提取方案以获得足量 RNA 用于下游的应用；以及规范样本的取样操作及保存条件，尽量降低 RNA 降解的风险。但还是有可能遇到 RNA 含量低，质量差的问题，该如何应对？
选择合适的文库构建试剂盒来优化文库构建环节不失为一种有效地补救措施，一般要关注以下三点：
兼容度：是否支持不同品质的 RNA 样本，甚至是高度降解的样本；
上文 Nature 论文中所使用的 Takara Bio 的 RNA 建库试剂盒 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian（Pico v2）就是满足上述需求，可以针对微量的、质量差的样本，构建转录组文库的建库试剂盒。同时，Takara SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3），在 Pico v2 的基础上，反转录步骤增加 8 nt UMI（分子标签），因此可以灵敏地识别 PCR 重复片段、校正 PCR 扩增错误并降低偏好性，从而进行正确的样本数据回溯，提供更可靠的 RNA-Seq 分析！
RNA 含量低，风险在于可能无法有效构建文库。这两个试剂盒可以从以下两个维度支持微量样本构建 RNA-Seq 文库！
其一，可以做到皮克级 total RNA 起始（范围支持 250 pg～10 ng 人、大/小鼠 total RNA）构建高品质文库！即使珍贵的微量临床样本，也无需过于担心样本量不足！
其二，不用先去除 rRNA！虽然在制备文库前从总 RNA 中去除核糖体来源的 RNA 有利于降低测序成本，提高数据 mapping 率。但微量样品起始时则有可能会造成纯化后的样品太少而不能制备合格的测序文库。这两个试剂盒，采用的方法则是先合成 cDNA 测序文库，之后特异识别并去除来源于核糖体 RNA 的 cDNA 片段。简单方便的同时，也省去了单独购买 rRNA 去除产品的烦恼和费用！
RIN 值反映的是 RNA 的完整性，数值越大表明 RNA 质量越好，完整性越高。RIN ≥ 8，表明 RNA 完整性好，无明显降解。RIN 越低则说明 RNA 降解越严重，其构建的文库风险在于有效数据低，mapping 率低，duplication 高。
这两个试剂盒均支持分析质量非常差（RIN3-10，DV200 ≥ 25%）的 FFPE、LCM、以及 cfRNA 等来源的样本！以随机引物起始，捕获全部 mRNA 和 lncRNA 在内的信息！
来看三个实际的应用案例：
FFPE 样本：FFPE 样本的 RNA-Seq 分析，能为 Biomarker 筛查、回顾性研究、疾病机制探讨提供可能。然而，由于处理、保存等条件的限制，FFPE 样本中不易留存高品质 RNA。同时，提取 RNA 前不当的前处理方案，不合适的扩增方法也不易获得足够量的核酸用于 NGS 分析。
实验范例：取 4 个不同降解程度的 FFPE-RNA 样本（DV200 在 28%～68% 之间），使用 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 制备文库，然后进行 NGS 分析。从数据中我们可以看出，① 无论 RNA 起始量高低，或降解是否严重，Picov2 均能获得约 10,000 的转录本检出数（FPKM ≥ 1），说明 Picov2 具备足够高的灵敏度；② 同一样本不同起始量之间数据的相关性系数达到 0.99，说明 Picov2 所制备的文库具备高度的可重复性。
cfRNA 样本：存在于人体循环系统中一些内源性或外源性微量 RNA 片段，包括 mRNA、miRNA 和 lncRNA 等。由于在体外易被 RNA 酶降解，cfRNA 完整性常常较低；加之提取的 cfRNA 常处于微量范畴，为科研工作者 NGS 分析这类样本增加难度。
文献范例：如本文开头所说，研究团队对来自 8 个独立队列的 1,840 名孕妇的 2,539 例血浆样本进行了 cfRNA 分析，就能在临床确诊几个月前预测孕期出现先兆子痫的风险。对 1,908 例 cfRNA 图谱进行机器学习和建模，并对 474 例样本进行测试，其准确性与妊娠中期的超声检查相似且优于妊娠晚期超声检查。在案例中，使用 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 对 cfRNA 样本进行文库构建，并进行了靶向富集测序。由此说明：Pico v2 非常适合 cfRNA 样本的可靠分析！
参考文献：Rasmussen M , Reddy M , Nolan R , et al. RNA profiles reveal signatures of future health and disease in pregnancy[J]. Nature, 2022, 601(7893).
LCM（激光捕获显微切割）样本：LCM 是利用激光在显微镜下切割分离出单个细胞或纯化单一类型细胞群的一种技术。切割部分可用于进一步的分子生物学方法，如 qPCR、NGS、蛋白质组学等。
文献范例： 研究人员对收集到的 1,082 份 BCa FFPE 标本，采用分层随机化方法分批处理标本。然后通过 LCM 获得切片用于后续实验。之后筛选出 DV200 > 15% 的样品用于后续 NGS 实验所用的样本。使用 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian Kit 制备 total RNA-Seq 文库，并在 Illumina NovaSeq 6000 测序（PE 200）,每个样本获得约 1×109 reads。
参考文献：Paul ED, et al. Multiplexed RNA-FISH-guided Laser Capture Microdissection RNA Sequencing Improves Breast Cancer Molecular Subtyping, Prognostic Classification, and Predicts Response to Antibody Drug Conjugates. Preprint. medRxiv. 2023; 2023.12.05.23299341.
以上数据结果表明：面对不同类型的获得的微量亦或是低品质样本，Pico v2 和 Pico v3 都可以胜任文库构建的任务！
看到这里，您可能打算买一个试试，但先别着急！
近期，Takara 对产品进行了升级，推出了 Takara SMART-Seq® Total RNA Pico Input (ZapR™ Mammalian)和SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian)，在保留前一代可靠性能的基础上，有效提升 rRNA 去除效率，以更好地剔除不需要的 reads 信息。
（注：这两个试剂盒分别是 Pico v2 和 Pico v3 对应的升级版本，不再包含 index）
选择 250 pg 的人脑 RNA 样本起始，使用 SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs 制备文库。之后分别采用 ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit 试剂盒中的模块处理（+）和未处理（-），然后通过 PCR 扩增进行富集或者不进行处理。同时，使用前一代版本产品 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian 对 250 pg 的人脑 RNA 样本制备文库。最后使用 CogentAP 对 3x106 PE reads 进行数据分析。如下图所示，与前一代版本产品相比，SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs（ZapR Mammalian）制备的文库，rRNA 相关 reads 百分比明显降低，外显子 reads 百分比增加！
使用 SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs（ZapR™ Mammalian）制备 10 ng FFPE RNA 文库（RIN = 3，DV200 = 77%）。使用 CogentAP 进行数据分析，使用 3x106 PE reads 进行数据分析。如下图显示，即使以降解 FFPE 样本起始，可有效去除 rRNA 来源 cDNA，并获得可靠的测序数据结果。
针对以上提到的建库试剂盒，近期均有促销活动，感兴趣的小伙伴可以看看哦![]()
内容策划：王丹琦
内容审核：朱超敏
图片及数据均来源于：Takara Bio USA, Inc.
