在过去几年中称为“液态活检”的新诊断概念已经有受到相当大的关注。 被肿瘤细胞释放血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）片段原则上与他们起源的肿瘤细胞含有相同的遗传缺陷。因此，可以在血浆的细胞游离DNA（cfDNA）中检测到的分子改变，跨越肿瘤中鉴定的基因组改变的类型，包括点突变，重排，扩增，甚至基因拷贝变异。
图1：实体肿瘤的液态活检：该图显示了基于循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环肿瘤细胞（CTC）的液态活检的生物学基础。还指出了液态活检在临床环境中的关键应用，包括肿瘤基因分型，评估药物反应，跟踪最小残留疾病和监测克隆进化。
相关的分子信息也可以通过分析存在于细胞外囊泡中的RNA分子来获得，例如外泌体或血小板。30多年前首次分离的外泌体是纳米级囊泡大多数类型的细胞。漂浮在几乎所有体液中的这些纳米颗粒的核酸和蛋白质丰富的含量具有非侵入性分子诊断的潜力，并且可以代表新的治疗递送系统。此外，外泌体还可以影响肿瘤生物学，并且它们的整联蛋白组成可通过确定器官特异性转移龛来促进转移。然而，目前的分离技术，如超速离心，不方便，不能实现高纯度的分离。这代表了一个有趣的挑战，可以用微流体技术解决，例如纳米等离子体外泌体技术，其中感测是基于表面等离子体共振来实现无标记的外泌体检测。特别地，来自肿瘤衍生的外泌体的蛋白质，RNA和DNA的富集和分析可能提供有关活肿瘤细胞的独特信息。已经在实体瘤如胰腺癌或卵巢癌患者中进行了鼓励证明临床相关性的原理证据研究。
最近，提出肿瘤学血清血小板（TEPs）作为肿瘤相关生物信息的替代来源。 来自不同类型的局部和转移性肿瘤和健康个体的患者的TEP的mRNA测序以96％的准确度检测到肿瘤。TEPs潜在诊断作用的生物学与血小板和肿瘤细胞之间的相互作用有关，其改变RNA 血小板并影响肿瘤生长和传播。关于TEPs的初步研究现在应该在更大的个体群体中得到验证。 特别是影响接受治疗和患病的癌症患者的mRNA含量的混杂因素需要评估。
在过去十年中，大规模的临床研究集中在使用循环肿瘤细胞（CTC）计数作为预后和对治疗反应的预测因子，特别是乳腺癌和前列腺癌。 虽然从血液中获取CTCs比血浆样品中的cfDNA分离更为麻烦，但CTC提供了获取DNA，RNA和蛋白质水平信息的机会。 此外，原理证明研究表明在一小部分患者中体外功能和体内分析是可能的。
在本综述中，我们专注于ctDNA和CTCs作为液态活检的关键组成部分的临床应用，并在这个快速发展的研究领域解决了开放性问题。
捕获分子异质性和癌症ctDNA的进化
分子和细胞异质性是癌症的标志，是肿瘤诊断和治疗最大的挑战之一。癌细胞的基因组不稳定性和表型可塑性导致病变特异性基因组表观。 与单一组织活检相反，血液携带衍生自位于不同转移位点的癌细胞的DNA。虽然目前的证据表明，ctDNA和CTC可能代表整体疾病的分子代谢，但仍然正式地证明位于不同器官中的多个转移性病变均匀分离了ctDNA和CTC。 尸体解剖组织和血液的分析可以进一步解决ctDNA如何阐明转移癌的异质性。
正常和肿瘤细胞释放DNA的机制是什么？
癌症患者的正常循环cfDNA水平高于健康人。当肿瘤体积增加时，细胞周转量也因凋亡和坏死细胞的数量也增加。 大多数cfDNA片段测量在180和200 bp之间，表明细胞凋亡可能在循环中产生大部分的cfDNA。 有趣的是，在至少一些肿瘤类型（例如肝细胞癌）以及数千个碱基对的大的cfDNA片段中已经报道了较短的ctDNA片段，这可能是坏死的结果。 液体活检正在迅速地纳入癌症患者的临床治疗中，但是还有待澄清的是，cfDNA的确切性质和起源尚待澄清。 这一领域的进一步进展动物模型和耦合ctDNA分析与自噬研究。
哪种体液含有循环肿瘤DNA？
大多数研究集中在癌症患者的血液（血浆或血清）中释放的cfDNA。值得注意的是，可以描述的体液类别最近已经远远超出血液，现在包括尿液，脑脊髓液（CSF）和唾液。例如，最近的研究已经表明，可以使用反式肾DNA来检测与耐药性相关的点突变，并且可以从CSF成功获得脑肿瘤的精确分子谱。头颈癌的分子情况可以从唾液中获得。每天可以获得尿液和唾液，从而提供纵向监测癌症患者的特征的可能性。在某些情况下，肿瘤的生物学及其解剖位置决定哪种体液最适合于液体活检。例如，虽然在大多数转移性癌症患者的血液中可以发现ctDNA，但脑肿瘤患者（如神经胶质瘤和成神经管细胞瘤）循环中的cfDNA数量往往有限。相反，CSF（由脉络丛分泌）可以成功应用于定位在脑中的肿瘤患者的ctDNA。
液态活检的临床应用早期检测和实体肿瘤基因分型：在血液真相？
迫切需要早期癌症特别是在晚期发现的肿瘤类型（例如肺癌和胰腺癌）的可靠指标。两种CTC和ctDNA均由早期肿瘤病变释放，因此具有引起研究团体和公司发展血液癌症测试的期望。尽管最近发展了非常敏感的技术，但是为早期癌症检测开发可靠的测试仍然具有挑战性。 特别是申请用于广泛群体筛选的血液检查需要精确的特异性。 癌症相关的突变发生在年龄的增加，即使在一生中从未发展过癌症的个体，这可能导致假阳性结果。
癌症筛查研究通常与癌症患者与对照（健康个体或良性疾病患者）进行比较。专注于发生癌症风险高的患者（如慢性阻塞性肺疾病）[COPD]患者）是加快此验证过程的有价值的策略。 Ilie等人（2014）报道，在无临床可检测的肺癌的COPD患者中检测到CTC。该研究包括168例COPD患者和77例无COPD匹配吸烟习惯的受试者。168例患者中有5例检出CTC，对照组未检出CTC。通过计算机断层扫描（CT）扫描筛查检测CTC阳性COPD患者的年度监测肺结节1-4年后CTC检测，导致晚期肺癌的手术切除和组织病理学诊断。这些初步结果需要在较大的队列中进行验证，并且可能导致非特异性的事件需要排除非癌症患者的发现，例如将非恶性上皮细胞释放到患者血液中。
通过监测ctDNA检测癌症也是积极调查的一个领域。然而，具有不同量的cfDNA的血液样本中非常少量的ctDNA的鉴定仍然存在挑战。 cfDNA组成主要来自正常细胞的DNA和源于肿瘤细胞的相对较小的部分。标准DNA分析方法（如Sanger测序）的灵敏度不允许检测ctDNA。除了敏感性，基于ctDNA的测试的特异性也是具有挑战性的。癌症相关的司机突变发生在年龄的增加，即使在一生中从未发展过癌症的个体。例如，在超过10％的非癌症对照中已经检测到TP53基因的突变，并且在10％的年龄较大的个体中观察到具有体细胞突变的克隆造血超过65岁，是后来血液癌症的强大危险因素。然而，从克隆造血转为血液癌的绝对风险是适度的（每年1.0％）。最近，Kato等人概述了良性病症中基因“驱动因素”的难题，如痣中的BRAF突变或脂溢性角化病的FGFR3突变。因此，检测cfDNA上的癌症相关突变可能并不表明所测试的个体在其一生中已经有癌症或将会发展成癌症。液体活检方法的兴趣显着增加，目前已有大量化验。欧洲联盟CANCER-ID（www.cancer-id.eu）涵盖37个机构，为国际化验验证提供了新的平台。
液态活检可检测和监测早期患者的最小残留疾病？
对血液恶性肿瘤患者的管理有效地采用了可靠的检测和定量的最小残留病变（MRD），但不能在实体瘤患者中进行。 早期检测微小转移灶目前无法通过临床成像程序（CT或MRI扫描）检测到，这将大大增加癌症的复发和转移性疾病的机会。 虽然ctDNA和CTCs在转移性患者中的疾病监测的临床相关性已经确立，但这些生物标志物在早期患者中的作用尚待确定。 MRD可能是液态活检的一个关键领域，在一个1,493名非转移性乳腺癌患者的大型研究中，Rack等 表明，化疗后持续的CTCs的存在显示出对无进展和总体生存的负面影响。
在非转移性癌症患者中，可以优化基于ctDNA的液态活检，可能在临床或放射学复发之前，以捕获和监测治愈性切除后MRD的基因组标志物，。类似地，ctDNA分析可用于分层患者谁是高风险的复发和避免低危患者不必要的全身治疗的毒性。例如，最近的研究表明，非转移性乳腺癌和结肠直肠癌患者血浆中肿瘤基因组改变的鉴定预计临床转移性复发的诊断，还发现手术后ctDNA的增加与除脑外的远处的转移灶的发生相关。总之，基于CTC和ctDNA的筛查具有较高复发风险的患者可能在临床转移发展前为治疗干预创造机会。 将MRD的高风险患者分层监测到更强烈的治疗是另一个重要的应用。例如，在手术切除原发性肿瘤后，Dukes B型结肠癌患者不接受辅助化疗。 然而，这些患者中的很大一部分（10％-20％）将在手术后5年内复发，并且通过RT-PCR分析外周血中plastin-3 RNA的CTC检测有助于预先确定这些高危患者。
我们可以使用液态活检来指导治疗吗？
目前对转移性疾病患者进行靶向治疗的决策是基于原发性肿瘤的分析。此外，已知药物治疗（化学或靶向）影响癌症的分子格局。重要的是，原发性肿瘤切除后多年可能发生转移性复发，从切除的原发性肿瘤获得的信息可能过时。 虽然转移性病变的再分期已经开始变得更加可接受，但是转移性病变的活组织检查是侵入性手术。相反，液体活检可以在治疗过程中重复分析，可以对治疗反应或实时抗药性的出现进行指导。 在本节中，我们重点介绍ctDNA和CTC的分子分析如何有助于更好地了解治疗抵抗力和改善个性化抗癌治疗的问题。
乳腺癌：
雌激素受体（ER）阳性乳腺肿瘤患者接受内分泌治疗，但可以携带ER阴性CTC。 这可能是潜在的抵抗机制，目前正在临床试验中进行评估。 ER基因的突变在20％的转移性乳腺癌患者的活组织检查中发现。 可以在ctDNA中容易地鉴定ER基因中的体细胞突变。 在乳腺癌患者的ctDNA中可以检测ER突变与抗内分泌治疗。 这些数据进一步表明，血液可用于鉴定单次转移性病变的测序未发现的其他ER突变。
编码磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的PI110a催化结构域的基因PIK3CA是乳腺癌中最常见的突变致癌基因，超过80％的体细胞PIK3CA突变发生在三个反复热点位置之一。 针对PIK3CA的几种药物临床使用。 用于检测转移性乳腺癌患者PIK3CA突变的血浆衍生ctDNA的分析是可行的。 值得注意的是，PIK3CA突变状态可以改变疾病复发。也可以在转移性乳腺癌患者的富集CTC库中检测到PIK3CA突变。分离单个CTC的分析导致PIK3CA突变检测率更高并且在PIK3CA突变状态中显示强烈的患者间的异质性。
HER2
致癌基因在大约20％的原发性乳腺癌中被扩增和过表达，并且可以在药理学上被有效地阻断。尽管原发性肿瘤目前用于将患者分层进行HER2导向治疗，但在远端转移和CTC中，与原发性肿瘤相比，在高达30％的病例中，HER2状态差异不显着。具有晚期ER阳性/ HER2阴性乳腺癌的妇女中的CTC可以在多个疗程后获得HER2阳性亚群。 值得注意的是HER2 +和HER2-的 CTC可以自发地相互转化，一个表型的细胞产生相反的子代，提示CTC内的动态功能状态可能有助于逃避HER2靶向治疗，需要新的治疗策略。
前列腺癌：
前列腺特异性抗原（PSA）和前列腺特异性膜抗原（PSMA）分别在雄激素受体（AR）激活和AR抑制后上调。有趣的是，基于PSA / PSMA的CTC测量似乎是CTC中AR信号的替代，这些信息可能有助于预测AR治疗的结果。 最近针对前列腺癌的研究也证明了mRNA CTCs分析可以揭示药物敏感性和耐药性的重要信息。例如，在CTC中缺乏配体结合结构域但保持组成型活性的AR的截短形式的AR-V7的mRNA表达可以预测恩替沙胺和阿维酮酮的抗雄激素治疗失败。
可以在前列腺癌患者的cfDNA中有效鉴定AR基因的突变。 转基因抗原前列腺癌（mCRPC）中cfDNA的AR基因组分析可以为恩沙拉坦反应和抗性。AR基因突变也可以在来自未行去势治疗前列腺癌患者的富含CTC的外周血样品中鉴定。检测到AR突变在35例CRPC患者中有20例：观察到19个错义突变，2个沉默突变，5个缺失和1个插入。 最近，来自前列腺癌患者的CTC的全部外显子测序为肿瘤进展提供了一个窗口。
