基因编辑技术发展现状与趋势：专访复旦大学生命科学学院王永明研究员

编者按：以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术强力推动了整个生命科学研究领域的大跨步的前进。 可以预期首先在先天性遗传性疾病、单基因疾病的治疗方面，会迅速取得突破。为此，生物谷在即将召开2017 第四届基因编辑与临床应用研讨会之际专访了复旦大学生命科学学院王永明研究员。

生物谷:  王老师您好,非常感谢您参加生物谷主办的2017基因编辑与临床应用研讨会, 并接受生物谷的专访。您主要从事基因编辑技术的开发和应用研究，可以请您谈一下CRISPR/Cas9的现状吗？距离建 立高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术还有哪些路要走？

回答：CRISPR/Cas9技术是2013年发展起来的基因编辑技术，被认为是继锌指酶(ZFN)、TALEN之后的第三代基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统包括两个元件，分别是Cas9内切酶和guide RNA(gRNA),gRNA引导Cas9蛋白在靶位点进行切割，形成 DNA双链断裂(DSB)。细胞的修复系统修复双链断裂的DNA时，会定点产生突变，这就是基因编辑。如果想改变不同的位点，只需要表达相应的gRNA就行了。细胞修复DNA主要依靠两种途径，分别是非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。非同源末端连接是高效的修复途径，修复系统对DNA末端做简单的修饰后重新连接在一起。这个过程经常会产生碱基的插入或缺失（indel），如果indel发生在编码区，就有可能造成移码突变，使基因失去功能，这种方法用于敲除基因。研究人员通常将表达Cas9和gRNA的质粒转染到感兴趣的细胞中来制作基因敲除的细胞模型。在转染效率高的细胞系如HEK293中，编辑效率一般在10-30%左右。有的细胞转染效率低，编辑效率也低，如在人的胚胎干细胞中编辑效率为1-25%。这时可以通过流式细胞分选仪将转染成功的细胞分选出来提高效率。我们最近利用附着体载体表达Cas9和gRNA，同时表达嘌呤霉素抗性基因，既可以长期编辑细胞，又可以富集转染成功的细胞，这是目前最高效的基因编辑技术，这种方法只适合于基因的敲除，在胚胎干细胞中效率最高可达到100%。

同源重组途径需要提供一个同源模板供体，可以是质粒或者单链DNA。DNA双链断裂处把供体遗传信息拷贝过来修复基因，这种方法的优点是可以精确的改变DNA序列，缺点是效率低。如何提高同源重组是基因编辑领域的一个重大挑战。利用质粒当作供体，同时加上一个筛选基因，这种方法的效率还是非常高的，但是制作供体工作量大，编辑后还要去除筛选基因，整个实验周期长。这种方法显然无法用于基因治疗，因为质粒供体无法导入体内细胞中。短的单链DNA oligo也可以做供体，合成DNA oligo成本低，速度快，同源重组后不存在去除筛选基因的步骤。但是这种方法重组效率很低，除了几种容易转染的细胞，在大多数细胞中难以检测到编辑成功的细胞。有几篇文章报道他们通过加小分子化合物或者优化oligo的设计方案得到了很好的编辑效率，但是我们的实验结果表明效率依然不理想。同源重组效率和编辑位点所处的基因组位置有很大的关系，有的位点容易发生同源重组，有的不容易。调控DNA修复途径可能会提高同源重组，但是目前提高的效果有限，调控DNA修复途径还会增加基因组突变的风险。所以如何提高同源重组还有很长的路要走。

生物谷:  去年韩春雨的NgAgo基因编辑技术闹得沸沸扬扬， 恰好您和南通大学神经再生重点实验室副教授刘东领导的团队一起发表了一篇题为《基于NgAgo的fabp11a基因敲低引起的斑马鱼眼睛发育缺陷》的文章， 当时文章里揭示了NgAgo有降低基因表达的现象， 对机理方面未作深入阐述， 请问后来您还在做这方面的机制研究吗？ 您对DNA引导的基因编辑技术有何看法？

回答：CRISPR/Cas9技术编辑的位点需要有GG序列，而NgAgo没有任何序列的限制，所以韩教授的发明引起了巨大的轰动。当时上海东方财经电视台还就这个热门事件采访了我。基因编辑技术的原创性工作都是在国外做的，韩教授这个发现改变了这种格局。我们在斑马鱼中测试了NgAgo的编辑效果，观测到了鱼的眼睛发生了表型改变，但是没有检测到基因编辑，也就是说DNA序列没有发生改变。但是，我们意外的发现 NgAgo可以降低基因表达,当时陆续有很多实验室声明利用NgAgo无法实现基因编辑，为了尽快分享我们的结果，没有做深入的机制研究就把文章发表了。后来韩国的一个课题组发现NgAgo可以利用单链DNA在体外识别并切断RNA，这部分解释了NgAgo降低基因表达的机制。我们在斑马鱼中的结果表明单链DNA不需要识别RNA也能降低基因表达，这就说明还存在其它降低基因表达的机制。我们正在探索新的机制，并取得了一定的进展，希望能尽快与大家分享。

DNA引导的基因编辑在理论上是可行的，在温度较高的情况下，某些Ago蛋白可以实现基因编辑。现在的问题是如何找到37度能实现基因编辑的Ago蛋白，或者如何让高温下工作的Ago蛋白在37度下工作。我们期待这一天早日到来，同时也期待韩教授在基因编辑方面取得突破。

生物谷:  我们了解到您和您的团队在研究运用基因组编辑技术把基因突变引入到人体多能干细胞中制作心脏病模型，通过这些模型研究先天性心脏病的发病机理和筛选治疗药物，这项研究进展如何可以跟大家分享一下吗？运用到临床上是提供一个可能伴有并发症的临时解决方案？还是都能做到真正修复损伤？

回答：干细胞领域是近些年发展非常快的一个领域，尤其是2006年日本科学家山中伸弥建立诱导干细胞技术以来。多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导干细胞，它有两个特点，一个是在体外能够连续培养依然保持多能性，另外一个是它可以分化为人体组织的各种细胞，这就为疾病研究和治疗打开了大门。从患有遗传疾病的患者身上获取皮肤细胞，诱导成干细胞，再分化成组织特异的细胞，就可以在细胞水平上研究疾病的发病机理，筛选治疗药物。除了这种方法，还可以通过基因编辑技术在正常的细胞中引入突变制作模型，这种方法更简单快捷，不需要寻找病人，正常的细胞还可以作为很好的实验对照。我在第一代基因编辑技术锌指酶技术刚商业化的时候就开始应用该技术制作心肌病模型，包括长QT综合征和肥厚型心肌病模型，这些模型可以用于机理研究和治疗药物的筛选。回国后由于精力有限，暂时没有继续这方面的研究，后面会继续开展这方面的工作。

利用基因编辑技术治疗疾病是目前的一个研究热点。主要有两种治疗策略，一个是将病人的细胞分离出来培养，利用基因编辑技术修饰细胞，再将细胞输回体内治疗。比如HIV病毒通过CCR5受体攻击T细胞。如果利用基因编辑技术将T细胞中CCR5基因敲除，HIV病毒就无法攻击T细胞，艾滋病就会得到治疗。但是用这种方法治疗除血液病之外的其它疾病非常困难，主要是细胞移植后难以存活。另外一种策略是直接将CRISPR/Cas9导入体内编辑致病基因。例如DMD基因突变会导致杜氏肌营养不良症，大多数突变发生在45-55号外显子上，导致蛋白表达在此处终止。如果利用基因编辑技术把45-55号外显子切除，后面的蛋白就可以表达，整个蛋白虽然中间少了一段，但是仍然可以发挥功能，小鼠实验表明肌肉功能得到改善。

心脏疾病通过细胞移植治疗是非常困难的，一个原因是移植细胞难以存活，另外一个原因是移植的细胞与原有的心肌细胞跳动不同步，引发心律失常，危及生命。有些心脏病的发生是由于显性负效应突变导致的。我们知道一个细胞中基因有两个拷贝，显性负效应突变使自己功能丧失的同时，还会降低正常基因的功能，如果利用基因编辑技术将显性负效应突变改为功能缺失突变，正常拷贝的功能不再受到干扰，也许会取得治疗效果。我们在做这方面的治疗研究。这种做法的一个风险是细胞中只剩下一个拷贝的基因，有可能表达剂量不足，无法治愈疾病。另外，在编辑突变的拷贝时，很容易将正常的拷贝也编辑了，这也是要克服的难题。这方面的治疗策略都是减轻病症，而并不是完全的修复。要想完全的修复损伤需要通过同源重组修复基因突变，这在体内是非常难实现的。最近有一种新的基因编辑技术，可以把一个碱基转变为另一个碱基，这为体内修复基因带来了曙光。这种技术存在效率低、脱靶率高等问题，在用于治疗前需要克服。

生物谷:  目前基因编辑已经应用到多个领域，吸引了很多的优秀人才开始尝试将基因编辑技术应用于人类各个行业的发展。针对CRISPR的局限，剪切导致的脱靶以及只能利用病毒载体运送DNA，现在有什么可行的解决方法么？

回答：脱靶剪切是大家都关注的一个问题，脱靶剪切的原因是基因组中有很多和靶向序列非常相似的序列，这些序列容易被识别切割从而产生突变，如果这些序列有功能的话，会引发疾病。科学家已经发明了一些降低脱靶的技术，一个是double-nicking技术，就是在Cas9上引入一个点突变，使得Cas9只能切断DNA双链中的一个链，同时表达两个gRNA，在DNA双链上分别产生一次切割，形成双链断裂，这就降低了脱靶。还有一种方法是在Cas9上引入几个突变，降低Cas9蛋白和DNA的非特异性结合，也可以有效的提高脱靶切割。这些技术在降低脱靶的同时，也降低了编辑效率。实际上，如果设计的gRNA序列在基因组中非常特异的话，脱靶效率是非常低的。包括我们在内的数个实验室通过实验均表明在干细胞中很难检测到脱靶。之前的几个课题组在研究脱靶时，选用的gRNA在基因组中都有非常相似的序列，这就造成了脱靶效率高的现象。在做基因治疗时，突变拷贝和正常拷贝往往只有一个碱基的差异，这时候确实存在很高的脱靶，需要谨慎编辑。在体内进行基因编辑治疗时，目前最有效的方法是利用病毒载体将CRISPR/Cas9系统导入细胞内。AAV病毒能够组织特异性的感染细胞，免疫排斥反应小，最具有治疗前景。一部分科学家在发明用化学试剂转染体内细胞，这种方法除了要克服转染效率低的问题，还要克服对细胞毒性大的问题。

王永明 研究员 

复旦大学生命科学学院

个人简介：研究员，博士生导师，2015年国家青年千人获得者。1997-2001年就读兰州大学生命科学学院并获得学士学位，2001-2004年就读东北师范大学生命科学学院并获得硕士学位，2005-2010年在德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心（MDC）做博士生研究，并获得柏林自由大学博士学位。2010-2013年在斯坦福大学医学院从事博士后研究。2013年至今历任复旦大学生命科学学院青年研究员、研究员。主要从事基因编辑技术的开发和应用研究，先后在Circulation Research,Journal of the American College of Cardiology, Nucleic Acids Research和PlOS Genetics等杂志发表重要文章。

王永明研究员将出席2017（第四届）基因编辑与临床应用研讨会，并带来“利用附着体技术在人体多能干细胞中实现高效的基因编辑”的主题报告。   

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