在生命的宏伟舞台上，细胞是最基本的演员，它们遵循着精密的剧本，演绎着生长、分化和死亡的循环。然而，当剧本被随机的笔触——也就是突变——所篡改时，一些细胞便偏离了正途，踏上了癌变的不归路。在这场细胞的叛乱中，髓系恶性肿瘤——包括急性髓系白血病（AML）——以其复杂的进化过程和治疗的挑战性，成为了医学研究的焦点。癌症的演变不仅仅是单一事件，而是一个多层面的过程，是一系列体细胞突变和表观遗传改变的累积，它们在细胞内部和外部的选择压力下，逐步推动着疾病的进展。在髓系恶性肿瘤中，表观遗传修饰因子（如DNMT3A和TET2）的突变在健康个体的血液中以亚克隆、低变异等位基因频率（VAF）的形式出现，并在白血病中作为克隆事件出现。尽管受体酪氨酸激酶FLT3突变在克隆性造血（CH）中较少见，但FLT3是AML中最常见的突变基因，通常在白血病发生过程中较晚出现。携带DNMT3A、NPM1和FLT3共突变的患者预后极差，代表了从癌前CH到明显AML的遗传转变。单细胞DNA测序（scDNA-seq）研究表明，包括NPM1和FLT3突变在内的特定突变对显示出更高的克隆适应性【1-3】。然而，由于缺乏确定性实验系统来评估体内顺序突变获取的后果，目前对突变协同作用的理解受到限制。现有的实验系统主要依赖于外源性过表达模型、Cre-Lox重组和CRISPR-Cas9基因编辑，但这些系统并不能充分解决顺序突变和上下协同作用的问题，尤其是对于FLT3突变，其内部串联重复（ITD）突变发生在白血病转化的晚期，但尚未在其他白血病疾病等位基因之后获得时进行研究。近日，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Ross L. Levine团队在Cancer Cell杂志上在线发表题为In vivo models of subclonal oncogenesis and dependency in hematopoietic malignancy的文章，开发了一组正交DNA重组酶工具，能够精确地模拟和控制白血病发展过程中的体细胞突变。这些工具包括Cre、Dre和Flp等重组酶，它们可以在不同的时间和顺序中激活或失活特定的基因突变，从而研究这些突变如何影响白血病细胞的转录状态和细胞命运。通过这种方法，研究人员可以更深入地理解合作突变如何影响细胞在癌基因激活或失活后的命运，这对于理解癌症的发展和治疗具有重要意义。这项技术的发展为未来癌症克隆演化的研究提供了新的实验模型和方法。为了研究获得性 Flt3ITD 激活对造血的影响，本文研究人员首先开发了一个内源性靶向的、Flp诱导型的Flt3Frt-ITD小鼠模型，该等位基因可以通过他莫昔芬 (TAM) 诱导的 Rosa26:FlpoERT2 等位基因进行体细胞诱导，全身性地激活Flt3ITD。通过给予TAM，研究人员能够在成年小鼠中实现超过50%的TdTomato报告基因激活，并通过PCR证实Flt3位点的重组。实验发现，激活Flt3ITD后，与野生型（WT）细胞相比，Flt3ITD细胞在竞争性移植中显示出持续的竞争优势。TAM处理的小鼠出现了早期的白细胞增多症，随后部分缓解，但伴随持续的贫血和血小板减少。研究结果表明，体细胞Flt3Frt-ITD突变导致突变衍生的髓系细胞扩张，以牺牲WT造血干细胞和祖细胞（HSPC）为代价；然而，一旦获得Flt3ITD，HSPC就失去了长期造血自我更新的能力。通过RNA测序分析，研究人员发现Flt3ITD激活后，HSPC的基因表达发生了显著变化，这些变化被分为短暂、持续和延迟三类响应。这些数据表明，负反馈的诱导和干细胞自我更新关键介质的表达降低是Flt3ITD激活的有害效应以及CH中FLT3突变的罕见性的主要原因。上述发现让本文研究人员提出一个假设，即同时发生的AML疾病等位基因与突变的FLT3合作，重塑基因调控网络，促进FLT3突变干细胞/祖细胞的克隆适应性。那么，协同突变是如何影响Flt3相关的白血病发生的呢？为此，研究人员又开发了两种小鼠模型，结合了已知的共同发生疾病等位基因：Flt3Frt-ITD与Flp诱导型Npm1Frt-c突变等位基因（NF模型）和Cre诱导型Dnmt3aLox-R878H等位基因（DF模型）。在NF模型中，Npm1Frt-c和Flt3Frt-ITD突变同时被激活，导致快速的白细胞增多和贫血，所有小鼠均发展为AML。相比之下，在DF模型中，Dnmt3aLox-R878H和Flt3Frt-ITD突变被顺序激活，其生存率与对照组无显著差异，但Dnmt3aLox-R878H-Flt3Frt-ITD小鼠能够传播疾病，且潜伏期较长。此外，通过转录组分析，研究人员发现两种模型的白血病细胞具有不同的转录特征和免疫表型，说明不同的合作突变以不同方式影响Flt3突变细胞的转化，从而影响白血病的发展和特性。随后，为了能够在小鼠模型中模拟人类癌症中常见的三种或更多病理性疾病等位基因，以及为了在方法上增加可逆的突变激活，研究人员又引入了Dre重组酶。他们开发了一种双重组酶策略——GOLDI-Lox，通过Lox和Rox位点的组合来控制突变的激活和失活。在非重组状态下，Lox位点的接近性阻止了Cre重组，而Dre激活后，目标位点被反转，允许后续Cre介导的重组。通过交叉GOLDI-Lox小鼠模型与Dre报告基因和TAM诱导的Ubc:CreER小鼠模型，研究人员验证了这一策略的有效性。与此同时，研究人员在HSPCs中感染Dre逆转录病毒，并在有无Cre激活的情况下，通过PCR证实了Dre激活能够反转目标位点，而随后的4-OHT处理能够删除目标位点。利用该策略，研究人员证实具有强大突变协同作用的共发生突变可以在同时激活时（如Flpo诱导模型中）或按照Cre/Dre模型的顺序激活时引发AML。进一步地，研究人员利用三重组酶模型（Dnmt3aLox-R878H、Npm1Frt-c和Flt3GL-ITD）来模拟AML的发展，研究发现，这些突变不仅能够诱导AML，而且它们的组合和激活顺序会导致不同的免疫表型变化，从而影响白血病的细胞层次结构。虽然Dnmt3a突变促进白血病前期HSPC的扩增，但Flt3突变是白血病转化时免疫表型HSPC扩增的主要驱动因素。不同的突变组合对白血病的免疫表型和细胞发育层次有特定的影响。已有研究方法的一个主要限制在于需要重复的移植/过继转移，这可能会导致特定克隆的选择性丧失，成为一个“瓶颈”。为了解决这个问题，本文研究人员开发了一种新的化学遗传学工具，用于模拟白血病。这些工具利用正交的DNA重组酶系统，可以在不依赖于移植的情况下，化学诱导多个突变的激活。具体来说，研究人员使用了一种名为StaPL（稳定肽链连接，stabilized peptide linkage）的方法，通过分割Dre重组酶并用HCV衍生的NS3蛋白酶抑制剂来控制其活性，实现了Dre重组酶的精确激活。这种方法允许研究者通过不同的小分子抑制剂（如grazoprevir）来控制Dre重组酶的活性，从而在体内精确地激活或失活特定的突变等位基因。利用这些化学-遗传工具，研究人员探索了改变突变顺序对白血病的发展和表型的影响，证明了多重组酶系统模拟不同突变序列的能力，其使得在没有移植的情况下对恶性肿瘤的体细胞突变进行模块化、确定性的控制成为可能，并表明突变顺序可以影响谱系状态和转录景观。最后，研究人员利用GOLDI-Lox等位基因在体内消除突变Flt3的表达来扰乱疾病的发展，以此来评估突变型Flt3在AML中的重要性。研究发现，实验TAM可以诱导CreER重组酶的激活，这会导致Flt3ITD突变基因的删除，从而导致白血病细胞数量减少，其部分原因是增加了细胞凋亡。此外，通过移植实验和对白血病细胞进行Flt3GL-ITD等位基因的删除，研究人员观察到白细胞数量和脾脏质量的显著降低，以及骨髓细胞的分化。研究结果表明，Flt3-ITD的逆转不仅改变了AML的炎症环境，还引起了对正常和白血病干细胞自我更新至关重要的HSPC基因调控网络的改变。突变Flt3的失活可以减少白血病负担并提高存活率，但是遗传性地消融Flt3对Flt3突变的AML细胞施加了足够的选择压力，以至于能够筛选出具有Flt3激活的残留克隆，而这可能促进了那些仍然依赖Flt3信号的白血病细胞克隆的生存和扩张，从而对治疗的长期效果构成挑战。综上所述，本研究通过运用正交重组酶技术，成功模拟了AML中顺序突变的获取，构建了与患者样本轨迹一致的疾病模型。这一创新方法不仅深化了人们对白血病转化机制的认识，还为探索突变顺序、突变发生的细胞类型以及突变克隆对白血病发展和治疗反应的影响提供了新的视角。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.10.009制版人：十一
1. McGranahan, N., and Swanton, C. (2017). Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell 168, 613–628.
2. Miles, L.A., Bowman, R.L., Merlinsky, T.R., et al. (2020). Single-cell mutation analysis of clonal evolution in myeloid malignancies. Nature 587, 477–482.
3. Papaemmanuil, E., Gerstung, M., Bullinger, et al. (2016). Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. N. Engl. J. Med. 374, 2209–2221.
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