今天这篇文章挺有意思，讲的是蛋白的CMA讲解，导致的钙离子失调相关的细胞衰老。这篇文章是华中科技大学协和医院的博士生，发表在14.6分的Autophagy上的文章。CMA（分子伴侣介导的自噬，这个是通过HspA8和LAMP2A结合蛋白，进入溶酶体讲解的过程，不记得的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列中的CMA那几章）相关的文章并不是特别常见，这篇文章算是做得不错的：
CMA其实就是一种降解蛋白质的途径，通过LAMP2A和HspA8结合蛋白后，将蛋白拉入溶酶体，进行消化降解。这篇文章关注的是IVDD（椎间盘退化）这个疾病中的CMA，在IVDD的过程中细胞衰老的一些标志，如TP53、CDKN1A和CDKN2A的表达都会有所升高（不清楚细胞衰老的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列的细胞衰老那几章，对于细胞衰老以及SASP，即细胞衰老分泌表型都有解释过）。炎症因子触发的NPC（髓核细胞）衰老，是IVD的主要成因。在TNF这样的炎症因子刺激NPC后，细胞内LAMP2A的表达明显下降了，于是他们假设TNF诱导的细胞衰老，可能有CMA的失调参与介导：
于是他们使用了KFERQ-PA-mCherry-1这样的荧光标记，来分析TNF刺激后CMA水平（这个要是看过《信号通路是什么鬼？》系列中CMA和自噬相关章节的话，应该能理解这个实验的原理KFERQ这个蛋白序列，是HspA8结合的氨基酸序列，HspA8会与LAMP2A将KFERQ-PA-mCherry-1带入溶酶体，而mCherry这样的荧光在溶酶体的酸性条件下不会淬灭）。结果发现TNF刺激后NPC细胞的CMA减弱了，其中LAMP2A的表达下降是主要原因。而他们通过过表达LAMP2A后，继续分析TNF对于NPC细胞的衰老诱导，则发现CMA增强，可以有效抑制TNF诱导的细胞衰老。
为了明确CMA对于NPC细胞的影响，他们使用了CMA抑制剂后，对NPC细胞进行了二代测序。结果发现，CMA抑制后，钙离子通路在NPC细胞中明显富集，而钙离子的浓度分析也显示，钙离子通路可能就是引发细胞衰老的关键。通过对钙离子通道的抑制（这就是柯霍氏法则的验证，通过抑制钙离子通路，来分析CMA对TNF诱导的细胞衰老的影响，是否通过钙离子通路，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》），他们验证了这个假设：
那么CMA过程中，消化的蛋白具体是什么呢？又是通过什么途径引发的钙离子通道的平衡被打破呢？那么关键就是要分析，到底什么蛋白被CMA降解了。于是他们对含有KFERQ序列的蛋白进行了分析，并通过免疫共沉淀，分析了能与HspA8和LAMP2A结合的蛋白，他们在结果中，找到了PLCG1这个潜在的CMA靶标底物。PLCG1（磷脂酶Cγ1），可以催化IP3(肌醇1,4,5-三磷酸)产生，并通过激活ER中的ITPR导致细胞钙浓度增加：
那接下去就要验证PLCG1是否会受到CMA的调节了，大家都知道蛋白的降解，有很多种途径，比如自噬、UPS（泛素化-蛋白酶体系，这个就涉及到E2和E3连接酶，将底物的泛素化，并通过蛋白酶水解的途径，这个在《信号通路是什么鬼？》系列中也介绍过）等。为了分析自噬或者UPS是否对PLCG1的降解产生影响，他们分别分析了PLCG1的泛素化，或使用3MA抑制自噬体和溶酶体结合，阻遏PLCG1的自噬。但这些都没有影响PLCG1表达水平。而CMA不需要通过自噬体和溶酶体的结合，也不用通过泛素化标记，而是LAMP2A对于PLCG1蛋白上KFERQ序列的识别，直接把蛋白拉入溶酶体的。结果显示PLCG1的确是通过CMA调控蛋白降解的：
那进一步验证PLCG1是否是CMA的底物，他们用了更精确的验证方法，就是对PLCG1的KFERQ序列进行突变。突变后PLCG1无法再结合HspA8和LAMP2A，也就无法被CMA调控降解了：
接着他们通过敲减PLCG1，来分析，PLCG1是否是CMA影响TNF诱导的细胞衰老过程中关键的一环（但这个环节使用了突变验证，并不太严谨，敲减后并不能说明是CMA造成的PLCG1导致的影响，可能会把问题扩大化，如果使用PLCG1在KFERQ序列上的突变进行进一步的验证，才能避免肯定后件的逻辑谬误，使得整个验证环节显得更严谨一些，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。而这个在CMA影响PLCG1表达后，PLCG1的累积会导致钙离子的失调，引发细胞的衰老：
而CMA的缺陷，是通过导致了PLCG1的累积，才引发了TNF诱导的细胞衰老：
最后他们就形成了这样的示意图，PLCG1在正常的NPC细胞中，会通过CMA调控降解，良性循环。而在TNF诱导后，CMA机制衰退，导致PLCG1的累积，从而引发了钙离子浓度提高，引发了NPC细胞衰老，NPC细胞的衰老则是引发IVDD疾病的关键：
好了，这篇文章其实做的还是不错的，如果能把最后的对于PLCG1的验证，通过突变PLCG1的KFERQ序列体现出来，那么就可以将CMA与PLCG1的表达更直接地联系起来，这样就比直接敲除PLCG1要强太多了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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