干货分享|病毒空斑纯化的原理、步骤及若干问题（含操作视频）

将各稀释度的病毒液接种到单层细胞培养环境中，吸附2小时后，在单层细胞上覆以琼脂糖，病毒感染细胞并在细胞中增殖，使细胞破裂死亡。由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向四周扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，即病毒蚀斑。经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞而不着色，形成不染色区域。

病毒蚀斑如噬菌体感染细菌形成的噬菌斑。理论上，当病毒液充分稀释后，获得的每个蚀斑均源于最初感染细胞的一个病毒颗粒，即蚀斑中的病毒为一个病毒体的繁殖后代品系，由此达到纯化病毒的目的。除了可用于纯化病毒以外，空斑实验还可用于干扰素、抗体中和病毒繁殖能力的实验。凡是能使宿主细胞产生细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。

    蚀斑技术除了可用于病毒纯化以外，还可用于测病毒滴度，其中所涉及的实验操作相似。此处献上2014年发布与JoVE上，通过空斑技术测病毒滴度的实验操作视频，为大家提供最直观的介绍。

来源：qq视频

1. 准备相应的病毒宿主细胞，消化均匀后调节细胞浓度，以适宜的浓度接种于六孔板中；

2. 待细胞长成单层后吸弃培养液；

3. 准备病毒液，进行十倍梯度稀释，获得五个浓度的病毒液。分别向每孔滴加适量病毒液，37°C下吸附2小时吸弃病毒液；

4. 制备2% 的低熔点琼脂糖溶液，置40~50°C水浴中待用；

5. 将上述琼脂糖与2×细胞维持液按1：1的比例混匀后，加入各培养孔中，2 mL/孔，冷却后凝固成覆盖层；

6. 倒置培养板，置于37°C二氧化碳培养箱中培养；

7. 每天观察细胞病变情况，出现明显病变时进行二次覆盖。取上述方法混合的混合液，加入中性红使其浓度为0.002%，向各培养孔中加入2 mL混合液，使其冷却凝固形成第二覆盖层；

8. 倒置培养板，置于37°C二氧化碳培养箱中继续培养，48小时内观察结果；

9. 选取合适大小的蚀斑下作病毒的下一步增殖和鉴定。使用1 mL的蓝色枪头，提前剪掉尖端部位，使枪头口径与蚀斑大小相仿，然后用移液器直吸取蚀斑，覆盖物也一起被吸入枪头。

（1） Q: 接毒细胞孔中细胞大量死亡，基本无病毒稀释度的差异？

A: 可能的原因如下：① 病毒稀释度不够。可先确定病毒滴度，再根据滴度选择稀释度；② 琼脂糖覆盖时温度太高；③ 实验所用细胞系不适合做蚀斑实验，可更换细胞系再尝试； ④ 观察时间比较晚。建议第一次做时，每隔12 h观察一次，大致了解细胞病变所需时间）。

（2） Q：做覆盖时琼脂糖和培养基混合液凝固得太快，还没加进去细胞培养孔里便凝固了，怎么办？

A：做蚀斑实验最关键的一点在于覆盖时动作既要缓慢以防止气泡产生，又要动作快，防止混合液凝固。一般六孔板的孔加2~3 mL就够了，可以用10 mL的吸管吸够10 mL可以加四个孔。还有就是，假如需要用30 mL的混合液铺板，那就需要多配至少20 mL，这样也可以防止因混合液太少，温度下降得快而较快凝固。

（3） Q：琼脂糖和培养液如何配制？

A：琼脂糖用三蒸水配成两倍浓度，培养液也配为两倍浓度。使用时，琼脂糖高温融化，在42°C保温，两倍浓度培养液在42°C水浴中恒温后，二者一比一混合保温于42度，尽快铺板。另外，中性红染液可以选择过滤除菌。