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揭示生物分子间的相互作用和调控关系有助于理解复杂的生物学过程，如发育、细胞分化、应激反应等。我们相对熟悉两个生物分子之间的相互作用研究，但仅研究两个生物分子之间的相互作用无法完整解析生物体内复杂的调控网络。解析调控网络往往涉及到对多个生物分子之间相互作用的研究，一旦涉及多个生物分子，情况就会变得复杂。生物分子可以结合在一起发挥某一具体功能，相互之间也可能存在竞争关系，那么这种竞争关系如何研究？小远准备了一些文献案例给大家展示了相关的研究思路与实验方法，希望对于大家的科研有所启发和帮助噢！
我们以三个生物分子为研究对象，聊一聊核酸和蛋白之间可能存在的竞争结合情况：a、两个核酸分子竞争结合某一个具体蛋白；b、两个蛋白竞争结合某一具体的核酸分子；c、一个核酸与一个蛋白竞争结合另一个蛋白；d、一个核酸和一个蛋白竞争结合另一个核酸。针对这四种情况，小远目前只找了b和c的文献案例，对于a目前还没有找到合适的文献，而d这种情况是否真的存在其实小远也不是特别肯定，如果有这种情况，那可能涉及小RNA的调控，这类文献案例也比较少，后面如果能遇到，再给大家分享a和d的文献案例。
2014年6月，浙江大学吴平团队在
Proceedings of the National Academy of Sciences
杂志上发表一篇题为“Rice SPX1 and SPX2 inhibit phosphate starvation responses through interacting with PHR2 in aphosphate-dependent manner”的研究论文，该文章为了验证SPX1和SPX2抑制PHR2与DNA结合的Pi依赖性，并检验Pi效应是否直接存在，作者采用Pull-down实验来确定P1BS基序是否分别与SPX1、SPX2竞争和PHR2的相互作用，并采用DNA结合实验来检验SPX1、SPX2对PHR2-P1BS相互作用的影响。
上述竞争实验分别用原核体系表达纯化的PHR2-His、SPX1-GST和SPX2-GST蛋白进行试验。Pull-down实验结果显示，只有在没有Pi的情况下，P1BS基序才可以取代SPX1、SPX2和PHR2相互作用（图1A）。相反，EMSA实验表明，SPX1和SPX2以剂量依赖的方式抑制PHR2与P1BS的结合，但仅在存在Pi的情况下（图1B）。不同Pi浓度下的EMSA和Pull-down实验分析也显示，Pi浓度与SPX1对PHR2的P1BS结合能力的抑制作用呈正相关。
图1 SPX1和SPX2在体外抑制PHR2与P1BS的结合是Pi依赖的(Wang et al., 2014)。（A）Pull-down实验表明，在−P条件下，SPX1和SPX2与PHR2的相互作用被P1BS探针取代，而在+P条件下（添加15mM Na
H
2
PO
4
），SPX1和SPX2与PHR2的相互作用没有被取代。每个泳道使用原核体系表达纯化的PHR2-His（50ng）、6×His（50ng）和GST-SPX1和GST-SPX2（250ng）蛋白，并使用不同数量的4×P1BS探针。（B）EMSA显示，SPX1和SPX2在+P条件下以剂量依赖的方式抑制PHR2与4×P1BS探针的结合，而在-P条件下则没有。使用PHR2-His（50ng）与不同量的GST-SPX1和GST-SPX2（0、50、100和300ng）蛋白和生物素标记的4×P1BS探针（100fmol）进行实验。（C）EMSA显示Pi效应对SPX1抑制PHR2结合P1BS的特异性。每个反应含有PHR2-His（50ng），GST-SPX1（250ng）和生物素标记的4×P1BS探针（100fmol）。对照（CK），在EMSA缓冲液中加入50mM NaCl；+Pi处理，添加15mM NaH
2
PO
4
和5mM NaCl；+Phi处理时，加入15mM NaH
2
PO
3
和5mM NaCl；+N处理，添加45mM NaNO
3
和5mM NaCl；+S处理，添加22.5mM Na
2
SO
4
和5mM NaCl。在B和C中，PHR2-4×P1BS复合物（黑色箭头）。
通过体内
31
P核磁共振（
31
phosphorus nuclear magnetic resonance,
31
P-NMR）分析发现，在土培或水培条件下，植物细胞质Pi浓度为0.3-0.5mM。在图2的A和B中，当Pi浓度降至0.25mM时，发现SPX1对PHR2结合的P1BS有明显的抑制作用，该浓度在Rouached等人报道的细胞Pi浓度范围内(Rouached et al., 2011)。
为了确定Pi效应对SPX-PHR2相互作用的特异性，作者测试了其他阴离子，如硝酸盐（N）、硫酸盐（S）和不可代谢的Pi类似物亚磷酸酯（Phi）对PHR2与P1BS结合的影响。EMSA结果显示，像Pi一样，只有Phi允许SPX与P1BS基序竞争结合PHR2（图1C）。这一发现加强了Pi作为直接信号的观点。作者还分析了在Pi存在的条件下，SPX1和SPX2的SPX结构域对PHR2与P1BS结合的影响，结果发现这些结构域足以抑制PHR2与P1BS的结合（图2C-E）。最后得出结论，SPX1和SPX2抑制PHR2与P1BS结合是Pi依赖的，并由SPX结构域介导。
图2 SPX1通过响应Pi浓度负调控PHR2的结合能力，SPX结构域在Pi存在时抑制PHR2与P1BS基序的结合(Wang et al., 2014)。（A）EMSA分析检测不同Pi浓度下SPX1对PHR2结合P1BS基序的抑制作用。按照PHR2-His（50ng/泳道）、GST-SPX1蛋白（250ng/泳道）和生物素标记的4×P1BS探针（100fmol/泳道）进行EMSA检测。（B）Pull-down法检测不同Pi浓度下SPX1对PHR2结合P1BS基序的抑制作用。在不同的Pi浓度下，利用原核体系表达纯化的PHR2-His（50ng/泳道），4×P1BS探针（100fmol/泳道）和GST-SPX1蛋白（250ng/泳道）进行Pull-down实验，用anti-GST检测GST-SPX1。（C）
IPS1
启动子区域图，包括EMSA的P1BS基序。（D）EMSA显示，SPX1和SPX2在+P（15mM Pi）的条件下抑制PHR2与P1BS基序的结合。使用PHR2-His（50ng/泳道）、GST-SPX1或GST-SPX2蛋白（250ng/泳道）和生物素标记的
IPS1
启动子（
IPS1pro
）进行EMSA实验。GST（250ng/泳道）作为对照。++，100倍摩尔多余的未标记探针。（E）EMSA显示，SPX1和SPX2的SPX结构域在+P（15mM Pi）的条件下抑制PHR2与P1BS基序的结合。使用原核体系表达纯化的GST-SPX1-N168（250ng/泳道）或GST-SPX2-N164（250ng/泳道）。黑色箭头表示PHR2-DNA复合体。
该文献案例用了EMSA和DNA Pull-down来验证一个核酸（P1BS基序）与一个蛋白（SPX1/SPX2）竞争结合另一个蛋白（PHR2）的情况，具体的实验方法在图注中都有介绍，如果需要开展相关的实验可以借鉴噢。
2020年10月，美国宾夕法尼亚大学Doris Wagner团队在
N
ature
C
ommunications
杂志上发表了一篇题为“TERMINAL FLOWER 1-FD complex target genes and competition with FLOWERING LOCUS T”的研究论文，该文章作者在确定了
LFY
是TFL1和FT双重调控的靶点后，进一步研究了TFL1-FT在该位点拮抗的机制。
为了帮助大家理解下面的内容，这里给大家介绍两个背景知识：
1、TFL1与FT具有相反的功能，FT促进生殖期的开始和花的形成，而TFL1作为开花抑制因子，决定了顶端分生组织转变为花序分生组织的时间和花序的分支模式，从而促进营养发育和分支命运。
2、FT和TFL1是小的可移动蛋白，它们与转录调控有关，但没有DNA结合域。生化和遗传学研究表明，FT通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子FD进行物理相互作用，TFL1也发现了类似的相互作用。因此，FT和TFL1需要与FD结合才能结合至对应的调控元件上去。
为了测试FT和TFL1在染色质上可能存在的竞争，作者对生长42天的FT-HA
ER
gTFL1-GFP（同时过表达FT CDS与TFL1基因组的拟南芥）短日照植物用模拟溶液（由0.1% DMSO（二甲基亚砜）和0.015% Silwet（表面活性剂）组成）或类固醇处理4小时后进行了Anti-HA ChIP-qPCR检测。雌二醇（属于类固醇）诱导FT-HA快速富集到
LFY
的第二外显子上，即FD和TFL1所结合的区域（比较图3a，b）。在同一样品上进行的Anti-GFP ChIP-qPCR发现TFL1占用率随之降低（图3a，b）。接下来，作者想知道内源性FT的上调是否也会导致TFL1在
LFY
位点的占用减少。为此，作者用单一远红光长日照光周期（FRP）处理植物以上调FT。同样，单个FRP处理显著降低了
LFY
染色质上TFL1的占用（图3c）。相比之下，FT的光诱导并没有改变FD的占用（图3d）。为了探究FT是否通过bZIP结合位点被招募到
LFY
的第二外显子，作者将FT-HA
ER
转化含有e2外显子的野生型拟南芥中或bZIP结合位点突变体（e2m3）中。在雌二醇诱导后，作者使用转基因特异性引物的ChIP-qPCR来监测FT与两个版本
LFY
e2的结合。结果显示，FT被单独招募到
LFY
e2（图3e）。此外，当三个bZIP结合位点发生突变时，FT不再被招募到
LFY
e2（图3e）。
综合数据表明，FT在
LFY
位点外显子bZIP基序上与FD结合的TFL1竞争。类固醇和FRP诱导FT都没有减少
TFL1
mRNA的积累，这一发现进一步支持了TFL1通过与FT竞争从LFY位点释放的观点。
图3 FT在染色质上与TFL1竞争（Zhu et al., 2020）。（a）使用的
LFY
位点和引物。（b）上图：模拟溶液（M）或类固醇（T）处理4小时后
LFY
位点的FT-HA
ER
占用率。下图：同一样本中gTFL1的占用率。（c、d）光周期（FRP，24h）上调
FT
对
LFY
位点TFL1（c）或FD（d）占用的影响。（e）经过4小时类固醇处理后，FT-HA
ER
募集到
LFY
外显子2（e2）或其bZIP结合位点突变版本（e2m3）的情况。上图；LFY外显子2（e2，黑色矩形）和T-DNA载体（灰线）。中图：扩增引物P1和P2的位置，每个扩增引物由一个外显子2特异性序列和一个载体特异性序列组成。下图：FT-HA
ER
ChIP-qPCR。（f、g）光周期（FRP）对图4所示TFL1-FD靶位点上TFL1占用的影响，以及图4所示TFL1-FD靶位点结合区域上经4小时雌二醇处理或未经4小时雌二醇处理的FT-HA
ER
占用的影响。（h）TFL1（紫色圆圈）和FT（红色圆圈）分别在促进分枝命运或成花命运中的拮抗作用模型。FT积累的增加导致FT与bZIP转录因子FD结合的TFL1竞争，并导致花的形成。
图4 TFL1和FD结合峰在促进生殖发育开始的基因（
SOC1
，
GI
，
CO
）或转向开花的基因（
LFY
，
AP1
，
FUL
）上的浏览视图（Zhu et al., 2020）。
这篇文献利用ChIP-qPCR实验分别检测了两个蛋白（FT与TFL1）在同一个结合位点（LFY外显子e2）上的结合情况，当一个蛋白结合变多，另一个蛋白的在该位点的结合就会变少，但结合减少的蛋白其mRNA并没有变少，因此推断出两个蛋白的竞争结合关系。另外该文献案例还有两个值得我们学习的点，第一个是FT和TFL1虽然是转录调控蛋白，但它们却不能直接与调控基因结合，需要有一个FD转录因子当桥梁间接去结合；第二个值得我们记住的点是转录因子并不一定只结合在启动子区域，这个案例就向大家展示了转录因子也可以结合在外显子上。
蛋白与蛋白的竞争情况不似核酸与蛋白的竞争情况有多种，一般蛋白与蛋白竞争结合就只有两个蛋白竞争结合第三个蛋白这种情况，并且验证蛋白竞争结合的实验方法比较多，因此，小远在这里也就相对多找了几篇文献案例给大家参考学习。
2011年6月，加州大学戴维斯分校Jorge Dubcovsky团队在
The Plant Journal
杂志上发表了一篇题为“Wheat flowering repressor VRN2 and promoter CO2 compete for interactions with NUCLEAR FACTOR-Y complexes”的研究论文，这篇文章作者在酵母细胞中验证了ZCCT1和CO2竞争结合NF-Y蛋白。
文中作者使用pBridge酵母三杂交（Y3H）系统验证了ZCCT1和CO2蛋白与8种常见相互作用的NF-Y蛋白竞争相互作用的假设。在第一个实验中，CO2与DNA结合域融合表达，ZCCT1作为竞争蛋白在MET25启动子（被培养基中的蛋氨酸所抑制）的控制下有条件地表达。对α-gal定量分析比较在ZCCT1存在或不存在的情况下，CO2和NF-Y蛋白之间的蛋白相互作用强度。结果发现在ZCCT1存在的情况下，CO2与8种NF-Y蛋白之间的相互作用显著降低（
P
<0.01，图5a），表明ZCCT1与CO2竞争与这些NF-Y蛋白的相互作用。
在第二个实验中，ZCCT1与DNA结合域融合表达，CO2作为竞争蛋白。当表达CO2时，ZCCT1与NF-YB3之间的相互作用被完全消除（图5b），这表明CO2对NF-YB3的相互作用强于ZCCT1。然而，CO2的存在并没有导致ZCCT1与NF-YC7或NF-YC11之间相互作用的显著减少（图5b），这表明ZCCT1比CO2对这两种蛋白的相互作用更强。ZCCT1与其他五种NF-Y蛋白（包括NF-YA7、NF-YA9、NF-YB1、NF-YB9和NF-YC10）之间的相互作用也因CO2的存在而显著降低（图5b），但降低的程度低于使用ZCCT1作为竞争蛋白的相互作用（图5a）。在与大多数NF-Y相互作用中，ZCCT1比CO2竞争的能力更强。
图5 ZCCT1和CO2蛋白与NF-Y蛋白的竞争相互作用(Li et al., 2011)。在没有竞争蛋白的情况下，蛋白质相互作用的α-半乳糖苷酶活性用灰色条表示，在有竞争蛋白的情况下，用黑色条表示。
由于ZCCT1与CO2、NF-Y蛋白相互作用，因此在Y3H检测中，ZCCT1与CO2-NF-Y相互作用的竞争可能是其与CO2、NF-Y或两者相互作用的结果。为了区分这些差异，作者利用具有独特特征的ZCCT1-R35W突变体，该突变体降低了ZCCT1与几种NF-Y蛋白相互作用的强度（图6），但对ZCCT1-CO2相互作用几乎没有影响。
作者选择了三种与ZCCT1相互作用受到R35W突变不同程度影响的NF-Y蛋白：NF-YB1（强影响）、NF-YB3（不受影响）或NC-YC11（中度影响）（图6）。ZCCT1-R35W突变体与NF-YB1的相互作用非常有限（图6a），其与CO2-NF-YB1相互作用的竞争能力显著降低（图7b）。在野生型ZCCT1蛋白存在时，CO2-NF-YB1相互作用降低了94%（图7a），而在突变型ZCCT1-R35W蛋白存在时，其相互作用仅降低了0.1%（图7b）。相比之下，ZCCT1和ZCCT1-R35W都显示出与CO2-NF-YB3相互作用竞争的能力（图7a，b），正如预期的那样，该突变无法影响ZCCT1-NF-YB3相互作用（图6）。最后，ZCCT1与CO2-NF-YC11互作的竞争强度部分受到R35W突变的影响（ZCCT1将CO2-NF-YC11互作强度降低了57%，而ZCCT1-R35W降低了28%），反映了该突变对ZCCT1-NF-YC11互作强度的中间效应（图6a和图7）。总之，在Y2H实验中，R35W突变对ZCCT1-NF-Y相互作用的影响（图6a）与突变对ZCCT1在Y3H实验中与CO2-NF-Y相互作用竞争能力的影响密切相关，但与它对ZCCT1-CO2相互作用的影响无关。这些结果表明，ZCCT1竞争是与NF-Y蛋白相互作用的结果，而不是与CO2相互作用的结果。
图6 CCT结构域突变对ZCCT和NF-Y蛋白之间蛋白相互作用强度的影响(Li et al., 2011)。突变包括（a）ZCCT1-R35W和（b）ZCCT1-R39C，（c）ZCCT2-R16C和（d）ZCCT2-R16C+R39C。ZCCT野生型（灰条）和突变型（黑条）蛋白与DNA结合域融合，NF-Y蛋白与激活域融合。α-Gal测定法用于量化相互作用的强度。
图7 CCT结构域突变R35W对ZCCT1-NF-Y相互作用及ZCCT1与CO2竞争的影响(Li et al., 2011)。（a）在Y3H实验中作为竞争者表达的ZCCT1野生型蛋白对CO2（与DNA结合域融合）与NF-YB1、NF-YB3和NF-YC11（与激活域融合）相互作用强度的影响。（b）在Y3H实验中作为竞争者表达的ZCCT1-R35W突变蛋白对CO2（与DNA结合域融合）与NF-YB1、NF-YB3和NF-YC11（激活域融合）相互作用强度的影响。
这篇文献案例利用酵母三杂实验验证了ZCCT1和CO2竞争结合NF-Y蛋白，并且ZCCT1与CO2、NF-Y蛋白都存在相互作用，因此作者进一步研究这种竞争关系的具体机制，最后得出结论：ZCCT1对CO2-NF-Y相互作用的竞争是其与NF-Y蛋白相互作用的结果，而不是与CO2相互作用的结果。关于酵母三杂的原理，大家如果不太清楚，可以参看之前的推文“
酵母杂交那些事儿（一）
”，推文中对酵母三杂的原理有介绍，并且在推文“
酵母杂交那些事儿（三）
”中也有其它关于竞争结合的文献案例，大家有兴趣可以阅读噢！
2021年6月，中国农业大学周涛团队在
Plant Cell & Environment
杂志上发表了一篇题为“Tomato chlorosis virus-encoded p22 suppresses auxin signalling to promote infection via interference with SKP1-Cullin-F-box
TIR1
complex assembly”的研究论文，作者利用RT-qPCR检测过表达p22转基因株系中响应生长素的基因的表达量，发现它们的表达量都降低，同时生长素信号抑制基因的表达量升高，表明p22可以抑制生长素信号传导，另外，通过蛋白互作实验证明p22可以结合到NbSKP1.1的C端结构域。由于SKP1的C端结构域又可以与F-box蛋白结合(Zheng et al., 2002)，因此，作者测试了p22是否会与F-box蛋白竞争结合NbSKP1.1。
由于大量的F-box蛋白被预测在蛋白质泛素化中起作用，同时p22可以抑制生长素信号传导，另外NbTIR1作为F-box蛋白可以识别Aux/IAA进行泛素介导的降解并触发生长素信号传导，因此作者选择NbTIR1进行竞争实验。通过蛋白相互作用实验，作者发现p22和NbTIR1.5都能结合到NbSKP1.1的C端结构域，但它们两者之间不互作。这表明p22有可能与NbTIR1竞争结合到NbSKP1.1的C端结构域，并干扰NbTIR1和NbSKP1.1组装成SCF
TIR1
复合物。
为了支持上述假设，作者进行了p22-eGFP竞争性Co-IP实验。在p22-eGFP浓度不断增加的条件下，在本氏烟草叶片中共表达NbTIR1.5-Flag和NbSKP1.1-3Myc。以共表达NbTIR1.5-Flag、NbSKP1.1-3Myc和eGFP的叶片作为对照（图8a）。结果显示，随着p22-eGFP量的增加，NbSKP1.1-3Myc中越来越多的NbTIR1.5-Flag被释放，NbTIR1.5-Flag释放到上清液中的水平也越来越高（图8a）。
然后，作者通过LCI分析了NbTIR1.5和NbSKP1.1在不同量p22存在下的相互作用。在不同浓度的p22-3Flag作用下，在本氏烟草叶片中共表达nLUC-NbTIR1.5和NbSKP1.1-cLUC。以共表达nLUC-NbTIR1.5、NbSKP1.1-cLUC和GUS-3Flag的叶片为对照（图8b）。结果显示，当p22的表达水平逐渐升高时，荧光素酶的荧光强度逐渐降低（图8b）。因此，得出结论，p22可以与NbTIR1.5竞争结合NbSKP1.1。
图8 ToCV p22与NbTIR1.5竞争结合NbSKP1.1(Liu et al., 2021)。（a）ToCV p22在Co-IP实验中干扰NbSKP1.1-NbTIR1.5相互作用的剂量依赖性效应。在p22-eGFP量不断增加的条件下，在本氏烟草下表皮细胞中共表达NbSKP1.1-3Myc和NbTIR1.5-Flag。用抗Myc琼脂糖珠免疫沉淀表达的蛋白。由ImageJ确定的条带强度被标记在条带下面。（b）p22-3Flag的高表达减弱了nLUC-NbTIR1.5和NbSKP1.1-cLUC之间的相互作用。该萤火虫荧光素酶互补成像实验是nLUC-NbTIR1.5、NbSKP1.1-cLUC分别与四种浓度的p22-3Flag在烟草叶片中共表达实现的。表达p22-3Flag的农杆菌浓度分别为OD
600
=0.2、0.4、0.6和0.8。以共表达nLUC-NbTIR1.5、NbSKP1.1-cLUC和GUS-3Flag的烟草叶片为对照。
这篇文献利用Co-IP、双荧光素酶两个实验证明了p22可以与NbTIR1.5竞争结合NbSKP1.1，并且这两个实验都是通过注射烟草叶片的方法进行的，因此在设计实验时，竞争蛋白的量是通过控制注射时农杆菌的OD值来控制的，其实这很难在最终的体系中保证竞争蛋白的具体含量，因此也有文献通过原核表达体系单独纯化竞争蛋白，再添加至另外两个蛋白载体共转烟草叶片提取的总蛋白体系中进行实验，这两种方法各有优缺点，大家可自行选择噢！另外对于利用GST pull-down研究蛋白竞争结合的文献这里就不再展示了，大家有兴趣可以自己去查找，篇幅有限，大家多多见谅！
小分子与蛋白竞争结合的情况相对也比较多，例如：a、两个小分子竞争结合同一个蛋白；b、一个小分子与一个蛋白竞争结合另一个蛋白；c、两个蛋白竞争结合同一个小分子，对于这多种情况，小远目前也只找到了b这种情况的文献案例，另外两种情况目前还没找到，后续找到了再给大家分享。
2019年1月，中国科学院微生物研究所刘军团队在
The Plant Cell
杂志上发表了一篇题为“Binding of the
Magnaporthe oryzae
Chitinase MoChia1 by a Rice Tetratricopeptide Repeat Protein Allows Free Chitin toTrigger Immune Responses”的研究论文，通过前面的研究，作者猜测在
M.oryzae
感染过程中，MoChia1可能与水稻外质体中的OsTPR1相互作用。因此，作者研究了这种相互作用的生物学意义。
为了帮助大家理解，这里补充几个知识点：a、几丁质是真菌细胞壁的关键成分，是植物与真菌相互作用的主要免疫激活剂；b、MoChia1是一种几丁质酶，以几丁质为底物，可以催化几丁质的水解；c、几丁质酶家族蛋白的序列比对表明，Glu137是几丁质酶中保守的氨基酸残基，此前曾报道它对几丁质酶活性至关重要(Lienemann et al., 2009)。因此，作者将MoChia1的Glu137（E）突变为Gln（Q）（MoChia1
E137Q
），这种突变破坏了它的几丁质酶活性。
MoChia1和MoChia1
E137Q
在体外几丁质Pull-down实验中能够结合几丁质（图9A），表明几丁质酶活性对于结合几丁质是可有可无的。OsTPR1也能结合MoChia1，因此，作者研究了它是否能与几丁质竞争结合MoChia1。结果显示，在几丁质Pull-down实验中，随着OsTPR1的加入量的增加，MoChia1的下拉量减少（图9A），表明OsTPR1可以干扰MoChia1与几丁质的相互作用。
为了进一步验证OsTPR1和几丁质之间在结合MoChia1方面的竞争，作者使用微量热泳动（MST）方法研究了它们之间的相互作用。结果表明，OsTPR1与MoChia1相互作用具有较小的解离常数（
K
d
，
K
d
=0.052）比几丁质与MoChia1的结合亲和力（
K
d
=0.31）高，表明OsTPR1对MoChia1的结合亲和力高于几丁质（图9B和9C）。相比之下，OsTPR1不能与几丁质结合（图9C）。当OsTPR1存在时，几丁质不能有效结合MoChia1，作者发现20mM重组OsTPR1导致几丁质和MoChia1的解离（
K
d
=1.34），而100mM OsTPR1几乎完全阻止了几丁质和MoChia1的相互作用（图9C）。这些数据证实了OsTPR1可以与几丁质竞争结合MoChia1，从而释放MoChia1结合的几丁质来激活免疫反应。
图9 OsTPR1与几丁质竞争结合MoChia1（Yang et al., 2019）。（A）OsTPR1干扰MoChia1结合几丁质的能力。左：几丁质酶活性对于结合几丁质是可有可无的。右：胶体几丁质和纯化的重组蛋白用于几丁质pull-down实验。每50μL的反应混合物中含有50μg胶体几丁质和2μg MBP-MoChia1。加入GST-OsTPR1蛋白（0、40、80μg），恒摇培养1h。（B）MST分析显示MoChia1与OsTPR1相互作用。重组蛋白存在于NT标准毛细管中。实线曲线是数据点对标准
K
d
-fit函数的拟合。（C）MST实验显示，OsTPR1与几丁质竞争结合MoChia1。
这篇文献作者利用MST技术分析了一个小分子（几丁质）和一个蛋白（OsTPR1）竞争结合另一个蛋白（MoChia1），其实MST技术可做的实验挺多，本来小远还想给大家介绍一下该技术的原理，但实在是篇幅有限，那就后续找机会再给大家介绍吧！
分析生物分子之间的调控关系至关重要，前期小远给大家介绍了许多关于相互作用的推文，这里给大家上升了一个台阶，多个生物分子之间的竞争关系如何研究？看完本文之后你会发现实验方法还是那些，想要验证一个结论更重要的还是思路，希望本期的推文可以带给你更多的思考噢！
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