湘潭大学李峰等JHM：评估三种蔬菜中抗生素耐药基因和机会性病原体食源性健康风险——体外模拟胃肠道消化

图片摘要

成果简介

近日，湘潭大学环境与资源学院李峰教授团队在 Journal of Hazardous Materials 上发表了题为 “ Assessing foodborne health risks from dietary exposure to antibiotic resistance genes and opportunistic pathogens in three types of vegetables: An in vitro simulation of gastrointestinal digestion ” 的研究论文，通过体外模拟人体胃肠道环境，揭示了三种不同种类蔬菜中 ARGs 及其致病宿主菌在土壤 - 蔬菜 - 模拟胃液 - 模拟小肠液传播链（ SVSTI ）过程中扩增传播规律，并且提出了基于 SVSTI 传播链中新的健康风险评估系统，该研究成果强调了摄入蔬菜中携带的 ARGs 和致病菌会对健康造成重大风险，因此迫切需要在蔬菜生产和消费过程中实施有效的生物控制措施 。

抗生素抗性基因（ ARGs ）和致病菌带来的食源性健康风险日益受到全球关注。然而，它们的扩增传播以及由此对人体健康造成的风险仍然未知。为此，作者通过采用叶菜类蔬菜（空心菜）、茄果类蔬菜（辣椒）和根茎类蔬菜（萝卜）研究 ARGs 和致病菌在体外模拟消化系统中的扩增传播规律。 研究结果表明， kan 、 oqxA 和耐多药类抗性基因沿着传播链分别富集了 1.10 倍、 11.2 倍和 2.21 倍。 细菌群落演替和由 int1 1 介导的水平基因转移（ HGT ）是驱动 ARGs 富集的主要因素。食用茄果类蔬菜增加了肠道菌群对环境 ARGs 和机会致病菌的暴露。此外，机会致病菌，如铜绿假单胞菌、鲍曼假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌，虽然在蔬菜中丰度较低，但仍然可以沿着传播链放大和传播。 KEGG 代谢通路分析表明， D- 丙氨酸代谢通路在传递链中对 ARGs 的扩增和繁殖起着重要作用。 D- 丙氨酸代谢、 PTS 、错配修复和肽聚糖生物合成等关键通路的富集，为 ARGs 和致病菌的存活和增殖提供了代谢基础。一种新型 ARGs 风险评估系统强调，传播链中的 kan 具有更高的传播能力，并对人类构成最大的潜在健康风险（ SVSTI1 ）。

图文导读

图 1. 传播链过程中叶菜类蔬菜（空心菜）、茄果类蔬菜（辣椒）、根菜类蔬菜（萝卜）中 kan 、 qnrB 和 oqxA 丰度变化。

蔬菜中 7 种 ARGs 丰度在进入模拟胃液环境后普遍呈下降趋势。在胃排空进入模拟小肠液后， kan 和 int1 1 丰度在所有实验组中表现出明显的增殖，增加了 1.58-15.5 倍。传播链中， kan 和 oqxA 在模拟小肠液中丰度显著高于土壤，丰度增加了 1.10 至 11.2 倍，显示出沿传播链富集的现象。进入模拟小肠液后，叶菜类、茄果类和根菜类蔬菜 ARGs 总丰度分别为 2.34×10 ⁸ -1.25×10 ⁸ 、 1.38×10 ⁸ -2.85×10 ⁸ 和 9.53×10 ⁷ -2.29×10 ⁸ 拷贝 / 克。茄果类蔬菜在小肠环境中携带 ARGs 的高流行率表明肠道暴露于 ARGs 的风险较大 。

图 2. (a) 土壤 - 蔬菜 - 模拟胃液 - 模拟小肠液传播链中独有和共享 ARGs 二分网络图。 (b) 传播链中细菌门丰度水平。 (c) 传播链中 ARGs 丰度 TPM 值。

传播链过程中 ARGs 类型主要涉及到对氨基糖苷类、 β- 内酰胺类、利福霉素类以及多药类等耐药性 。蔬菜中 ARGs 在进入模拟胃液环境后种类多样性没有发生显著变化，而 ARGs 总体丰度显著下降。在进入模拟小肠液后， 多药类耐药基因是 ARGs 丰度增加的主要贡献者，其丰度是蔬菜的 2.21 倍。 小肠环境中耐多药基因的增殖表明多药类 ARGs 暴露于肠道微生物群的风险更高。在环境介质中广泛检出的四环素类、磺胺类和 MLSB 类耐药基因的丰度在传播链中没有显著变化。环境介质中 ARGs 的高检出率并不一定与人体健康风险相关。蔬菜中高丰度的 ARGs 更容易在小肠环境中持续存在，蔬菜中 ARGs 丰度是影响肠道 ARGs 暴露风险的重要因素 。

图 3. (a) 传播链中 18 种共享机会性病原体丰度。 (b) 传播链中病原体数量。 (c) 传播链中病原菌 TPM 值。

图 4. (a) PcoA 分析显示细菌群落在传播链中的分布。 (b) 香农多样性指数 (c) Chao1 多样性指数。采用单因子方差分析样本间差异的显著性（ P<0.05 ）。

图 5. (a) 、 (b) 、 (c) 、 (d) 土壤、蔬菜、模拟胃液和模拟小肠液中细菌群落与可移动基因元件（不含 intl 1 ）和 ARGs 之间的相关性。 (e) 主要细菌门、 intl 1 和 ARGs 在传播链中的冗余分析。 (f) 传播链中 ARGs 和潜在机会致病宿主细菌共线网络分析。

土壤样品中 qnrB 和 oqxA 与非 int1 1 的 MGEs 存在显著相关性，但在蔬菜、模拟胃液及模拟小肠液中，非 int1 1 的 MGEs 与七种 ARGs 无显著相关性。冗余分析表明，厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、黏菌门以及 intl 1 是影响 ARGs 在传播链中迁移转化的主要因素。共线性网络分析表明，炭疽芽孢杆菌是 kan 潜在宿主菌，芽孢杆菌属作为模拟小肠液中优势菌属及 ARGs 潜在宿主，传播 ARGs 至肠道菌群的风险更高。令人担忧的是，铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌与众多 ARGs 之间的强相关性突出了传播链中机会性致病宿主细菌的流行。

图 6. (a) 土壤 KEGG 通路富集。 (b) 蔬菜 KEGG 通路富集。 (c) 模拟胃液 KEGG 通路富集。 (d) 模拟小肠液 KEGG 通路富集。 (e) KEGG 代谢通路与 ARGs 在传播链中的相关性分析。

KEGG 分析表明， D- 丙氨酸代谢通路在传递链中显著富集（ p<0.01 ）。错配修复通路和肽聚糖生物合成通路的富集促进了胃酸环境下 ARGs 和致病菌的繁殖。而蔬菜中柠檬酸循环通路富集为携带 ARGs 的细菌和致病菌提供了必要的能量。 D- 丙氨酸代谢和肽聚糖生物合成的增强直接导致 β- 内酰胺耐药，磷酸转移酶通路的富集则增强了多药外排泵功能。芽孢杆菌属作为模拟小肠液中的优势菌群（ 82.7% ）， D- 丙氨酸代谢通路和错配修复通路的富集使其代谢适应增强，显著提高了芽孢杆菌属耐药菌向肠道微生物群传播 ARGs 的风险。此外， tetA 与 D- 丙氨酸代谢通路、 TCA 循环代谢通路的显著相关性，进一步凸显了 D- 丙氨酸代谢在 ARGs 传播中的重要作用。

图 7. (a) 土壤 - 蔬菜 - 模拟胃液 - 模拟小肠环境中 ARGs 的新型风险评估程序。 (b) MGEs 与七种 ARGs 之间的相关性分析。

一种新型风险评估系统同时考虑了环境和人为因素，强调了评估 ARG 健康风险的六个基本要素。首先考虑的因素是 ARGs 在环境介质中的迁移能力，特别是从土壤向蔬菜种植系统的转移，这与食物链中污染风险直接相关。第二个因素涉及评估 ARGs 通过 MGEs 进行 HGT 的能力，这是促进 ARGs 在微生物群落中快速传播的关键机制。第三个因素涉及评估宿主细菌适应胃液中高酸性（ pH=2 ）和厌氧条件的能力。第四个因素是评估 ARB 的致病性，这是暴露于 ARGs 导致临床感染风险的直接指标。第五个因素强调 ARGs 在小肠液环境中的扩增和传播，这与环境中的 ARB 将 ARGs 转移到肠道微生物密切相关。最后，全面分析 ARB 对多种抗生素的交叉耐药性对于评估公共卫生安全相关的风险至关重要。

在新型风险评估系统中， tetA 和 MCR 被归类为 SVSTI5 ，因为它们能够在胃液的强酸性和厌氧条件下生存，而不被 MGEs 携带。相比之下， qnrB 和 dfrA10 被归类为 SVSTI3 ，因为它们不能在小肠液环境中增殖。 OqxA 被归类为 SVSTI2 ，因为它的潜在宿主菌对大多数抗生素没有表现出耐药性。 kan 符合新评估系统中列出的所有六个标准，因此被归类为 SVSTI1 。小肠液环境中芽孢杆菌属和多药耐药基因的增殖表明肠道 ARGs 暴露导致人体患病风险增加。高风险 ARGs 往往与 MGEs 相关，并被各种致病菌所携带，从而增加了环境传播的风险，对人类健康构成重大威胁。

‘’

综上所述，本研究发现， kan 和 oqxA 能够在土壤 - 蔬菜 - 模拟胃液 - 模拟小肠液传播链中富集，细菌群落演替和由 int1 1 介导的水平基因转移（ HGT ）是驱动 ARGs 富集的主要因素。茄果类蔬菜的食用增加了胃肠道菌群与环境 ARGs 及机会致病菌的接触机会。相较于其他菌属，芽孢杆菌属造成的食源性健康风险较高。铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌等低丰度机会致病菌能够在传播链中发生扩增传播。 KEGG 代谢分析表明， D- 丙氨酸代谢等关键通路的富集为 ARGs 和致病菌的生存增殖提供代谢基础。新型 ARGs 风险评估系统强调，传播链中的 kan 具有更高的传播能力，并对人类构成最大的潜在健康风险（ SVSTI1 ）。因此，蔬菜生产和消费过程中减少 ARGs 及相关机会性病原体污染至关重要，实施有效食品安全措施和卫生管理策略对保障公众健康具有重要意义 。

项目致谢： 本研究受到了国家环境保护城市土壤污染控制与修复工程技术中心开放基金资助项目（ USCR-202208 ）资助。