如何入门胚胎干细胞研究？与表观修饰“联姻”！

诚然，人胚胎干细胞的体外分化和定向分化的研究，有着深远的潜在用途吸引着研究者的眼球，例如：通过定向分化诱导产生各种特定的细胞和组织，将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官，从而治疗许多疾病，如帕金森病、老年痴呆症、脊髓损伤、脑卒中、烧伤、心脏病、糖尿病、白血病、骨关节炎等。但是，胚胎干细胞培养技术复杂，培养体系昂贵提升了研究的准入门槛，令很多研究者对之垂涎三尺而又望而却步。

今天就来和大家分享一篇近期发表在《Cell reports》上的文章，初步揭开胚胎干细胞研究的面纱。

文章标题：Trimethylation and Acetylation of b-Catenin at Lysine 49 Represent Key Elements in ESC Pluripotency.（回复17330下载该文献）

该论文主要关注β-catenin的表观修饰在胚胎干细胞（ESC）的全能性维持和分化过程中发挥的作用（见下图）。

前人研究表明Wnt/β-catenin信号通路通过促进中胚层分化，抑制神经元分化影响ESC的全能性，但是β-catenin调节胚胎干细胞分化的机制并未揭示。本研究发现β-catenin的第49位赖氨酸既可被Ezh2三甲基化（β-catMe3）也可被Cbp乙酰化（β-catAc）。三甲基化的β-catenin扮演着神经元分化基因sox1和sox3的转录抑制因子和中胚层分化基因t-bra的活化因子的角色。

β-catMe3和β-catAc在ESC分化为神经元细胞和中胚层分化过程中分别富集在抑制基因和活化基因上。需要重点指出的是，β-catenin的第49位赖氨酸突变后造成ESC分化功能受损。因此，β-catenin的第49位氨基酸的三甲基化和乙酰化在ESC全能性保持和分化潜能调节中发挥重要作用。

那么作者是怎样得到这些结论的呢？我们通过三张图来看。

第一：β-catenin的第49位赖氨酸被Ezh2甲基化

采用Silac方法，作者发现β-catenin可与PRC2 复合物的包括Ezh2在内的主要成分相互作用。并进一步采用Co-IP和pull down实验证明以上结论。同时，体外甲基化实验表明Ezh2是β-catenin甲基化底物，并发现甲基化位点在外显子3上。而外显子3上可能发生甲基化的位点分别为K49和K19，通过氨基酸突变法，最终发现K49是β-catenin的甲基化位点。

第二：β-catenin翻译修饰后主要富集在发育基因的启动子区域

为了进一步研究β-catenin表观修饰的功能，作者建立了β-catenin K49甲基化和乙酰化特异性抗体。随后，在WT和β-catenin-deficient（β-Cat-/-）ESCs分别加入Wnt3a和Wnt模拟试剂CHIR99021，发现神经元特异性基因sox1和sox3的表达下降，中胚层特异性基因t-bra表达升高。

进一步的Chip实验表明当加入CHIR99021后，β-catenin 的乙酰化产物β-catAc在t-bra的启动子区域检测到，甲基化产物β-catMe3可在sox1和sox3的启动子区域检测到。

第三：第49位氨基酸突变影响ESC全能性和分化潜能

最后，作者采用体内体外功能缺失实验，发现β-catenin K49突变后导致ESCs中t-bra，sox1，sox3 mRNA表达下降，从而导致ESC细胞无法分化为中胚层祖细胞和神经元结构。

由以上分析，我们可以看出本文是一篇典型的胚胎干细胞表观修饰方向的研究论文，对于这一类研究我们可总结出一套完整的研究思路（见下图）。

表观修饰可分为四类：泛素化，磷酸化，甲基化和乙酰化。它的研究重点可总结为以下两个方面：阐明酶和底物相互作用的机制和酶/底物介导的效应。

研究酶和底物相互作用的机制通常需阐明酶和底物的表观修饰类型和作用位点/区域。如本文在结果部分详细的解释β-catenin的三甲基过程和乙酰化过程。这部分研究的精细程度决定了文章的档次。

酶/底物介导的效应的效应是多种多样的，在肿瘤研究中通常包括细胞增殖，细胞凋亡，转移等。而在干细胞的研究中，可包括多能干细胞多能性的维持和分化能力等。其中多能性的维持可通过检测SSEA-1，Oct-1等的表达确定。分化能力可通过分化获得靶细胞的生物学功能检测确定，检测指标包括：标志物变化，细胞形态学变化和基因表达谱变化。

参考文献：Trimethylation and Acetylation of b-Catenin at Lysine 49 Represent Key Elements in ESC Pluripotency.