Plus深读 | lncRNA，EPIC1能够与MYC结合，作为“原癌基因”促进细胞增殖和肿瘤发展

首先，为了分析lncRNA编码区附近的DNA甲基化水平，研究者结合已有数据库和测序结果进行大批量的数据分析，得到差异性的调控lncRNA并验证其在肿瘤发生中的作用，主要流程如下：

1：肿瘤组织中的lncRNA的TSS位点附近，DNA甲基化水平既可能升高也可能降低

备注：界定甲基化是标记lncRNA还是编码基因（PCG）的：

分析发现有趣的现象：在乳腺癌（Fig.1A,S1C）以及其他几种肿瘤中（Fig.1B,S1D），蛋白编码基因（PCG）的TSS附近绝大部分位点甲基化修饰水平很高，而lncRNA的TSS附近则既有高甲基化（Fig.1C，S1C-D）、也有低甲基化的分布（Fig.1A-C），这提示了在肿瘤发生过程种，lncRNA附近的甲基化水平存在着与PCG不同的调控模式。

Figure 1

Figure S1

2：筛选在多种肿瘤中表达、DNA甲基化水平有变化的lncRNA

接下来研究者结合分析TCGA等数据库的DNA甲基化测序、和lncRNA表达谱测序，在12382个与肿瘤相关的lncRNA中，寻找符合：

1）肿瘤中存在表达变化；

2）表达变化水平与其promoter上的DNA甲基化水平相符；

的lncRNA，共计2123个，其中Figure 2A和2D列举了top 20被激活（epigenetically activated，EA）和抑制（epigenetically silenced，ES）的lncRNA，在20种tumor组织、以及细胞系中的表达变化。并且这些lncRNA的表达水平也与DNA甲基化水平呈现负相关（Fig.2B-C）。

Figure 2

3：EA型的lncRNA EPIC1，能够影响乳腺癌生存

序列分析找到EPIC1编码区TSS下游164bp处存在一个CpG岛（Fig.3A），通过上面的DNA甲基化水平高低，将乳腺癌分为三种类型（Fig.3B-D）：

1）高甲基化-EPIC1表达低，预后较好生存周期更长；

2）中度甲基化；

3）低甲基化-EPIC1表达量高，预后最差。

EPIC1的表达水平直接受到DNA甲基化水平的调节（Fig.3I）。

Figure 3

4：EPIC1能够调控细胞周期，促进细胞增殖

如Figure 4，利用siRNA分别敲低乳腺癌细胞系、悬浮细胞、以及移植瘤中的EPIC1表达，都发现细胞增殖受到抑制。

Figure 4

5：EPIC1定位于核内，能够调控MYC相关的下游基因

如Figure 5A，EPIC1 lncRNA主要集中于细胞核内。将EPIC1敲低后进行RNA测序、GSEA分析和WB，都发现差异基因与MYC通路有很大重合（Fig.5B-G）。

Figure 5

6：EPIC1直接结合MYC

RNA IP实验证明，EPIC1在细胞内能够直接结合MYC（Fig.S6）。过表达实验证明，只有V1 isoform能够调控MYC相关下游基因表达，进而影响细胞周期、细胞增殖（Fig.S6）。进一步的体外Pull-down以及截短实验进一步证明了MYC的148–220 aa与EPIC1的129–283 nt是直接结合的区域（Figure 6）。

Figure 6

Figure. S6

7：EPIC1结合MYC共同调控下游基因的转录

研究者发现EPIC1敲低能够影响经典的MYC下游基因，例如p21和CCNA2的表达（Fig.7A）。通过分析MYC ChIP结果和siEPIC1的RNA测序结果，研究者找到了40个下游基因，并用ChIP-PCR证明其可能受到EPIC1和MYC联合调控（Fig.7B-C）。EPIC1过表达会导致MYC下游基因的表达变化，但再敲低MYC后这种变化就不再明显（Fig.7D-E）

Figure 7

Reference:

1）Iyer, M.K., Niknafs, Y.S., Malik, R., Singhal, U., Sahu, A., Hosono, Y., Barrette, T.R., Prensner, J.R., Evans, J.R., Zhao, S., et al. (2015). The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. Nat. Genet. 47, 199–208.

2) Tseng, Y.Y., Moriarity, B.S., Gong, W., Akiyama, R., Tiwari, A., Kawakami, H., Ronning, P., Reuland, B., Guenther, K., Beadnell, T.C., et al. (2014). PVT1 dependence in cancer with MYC copy-number increase. Nature 512, 82–86.

3）Guttman, M., Amit, I., Garber, M., French, C., Lin, M.F., Feldser, D., Huarte, M., Zuk, O., Carey, B.W., Cassady, J.P., et al. (2009). Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals. Nature 458, 223–227.