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JCB丨史岸冰团队报道脂蛋白分泌晚期阶段的囊泡捕获调控

BioArt · 公众号 · 生物 · 2025-02-23 09:10

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细胞分泌是生命活动的基础过程。从神经递质的释放到激素的分泌，从免疫球蛋白的产生到消化酶的输出，都依赖于精确的细胞分泌过程。然而，这一过程中的分子调控机制仍存在诸多未解之谜。

2025年2月21日，华中科技大学同济基础医学院 史岸冰 课题组针对细胞极性分泌晚期阶段的调控开展研究，发现了一种此前未见报道的分泌囊泡锚定捕获机制。这项发表在 Journal of Cell Biology 上的研究（题为： RAB-10 cooperates with EHBP-1 to capture vesicular carriers during post-Golgi exocytic trafficking ）大量运用遗传学分析，深入解析RAB-10/Rab10及其效应蛋白EHBP-1/Ehbp1如何通过协作，调控细胞内脂蛋白分泌囊泡向细胞膜的定向运输过程，为理解极性细胞中定向分泌调控提供了新的科学细节。

研究团队选择秀丽线虫、人类肝细胞作为模式体系，通过一系列细胞学实验策略，探索了RAB-10/Rab10和EHBP-1/Ehbp1在极性脂蛋白分泌过程中的作用机制。

本研究采取了RNAi反向遗传筛选策略，首先对22个已知的Rab家族蛋白进行了筛查。为避免基因敲除带来的严重表型影响实验判读，对于一些关键基因如snap-29、snap-1、sec-5等，研究人员特别选取了在线虫L2-L3期进行RNAi处理的策略，这样可以在young adult阶段观察到相对温和的表型。在筛选中，研究人员发现RAB-10的缺失导致卵黄载脂蛋白VIT-2在细胞内异常累积，同时体腔中的VIT-2含量显著降低。此前研究提及的调控顶膜端分泌的RAB-10旁系同源蛋白RAB-8的缺失并未导致类似表型，而RAB-5的缺失则导致VIT-2在体腔中累积但卵母细胞中含量降低，提示其可能参与卵母细胞的脂蛋白内吞过程。这种系统性的筛选不仅确定了RAB-10在分泌过程中的特殊作用，也帮助绘制出了不同Rab蛋白在极性分泌-内吞网络中的功能图谱。为了研究RAB-10的分泌调控效应，研究团队进一步对已知的RAB-10互作蛋白进行了筛选，包括EHBP-1、TBC-2、CNT-1、HUM-2等在肠道中参与循环的蛋白，以及JIP-1、KLC-1、KLC-2、KLP-4等在神经轴突发育中起作用的蛋白。通过这轮筛选，他们发现只有EHBP-1缺失会导致VIT-2分泌缺陷，这一发现将研究重点指向了EHBP-1。

在技术方面，研究人员利用heat shock-inducible CRISPR-Cas9系统构建了 ehbp-1 条件性突变体，实现了对EHBP-1功能的时空特异性调控。同时，研究人员通过CRISPR-Cas9介导的同源重组，在不影响基因原有表达调控的前提下，将mNeonGreen-3xFlag和wrmScarlet标签分别整合到VIT-2和RAB-10的基因位点，获得了内源标记的融合蛋白。利用高分辨率共聚焦显微镜进行活体成像，研究人员观察到在RAB-10或EHBP-1缺失的线虫中，原本应该分泌到体腔的卵黄蛋白VIT-2在肠道细胞内异常累积。进一步的透射电镜分析揭示，突变体中出现大量直径约200nm的电子致密囊泡，这些囊泡的数量较野生型显著增加，但形态保持不变。这一发现暗示RAB-10和EHBP-1可能参与调控脂蛋白囊泡的运输过程，而非囊泡的形成。

为了理解RAB-10和EHBP-1的作用机制，研究团队开展了一系列生化和细胞生物学实验。表达并纯化了RAB-10和EHBP-1的各个功能结构域，通过体外结合实验发现，EHBP-1的CC结构域能够特异性地识别处于GTP结合状态的RAB-10，EHBP-1的C2结构域可以与膜脂PI(4,5)P2结合，这种结合对EHBP-1定位于循环内吞体至关重要。研究人员建立了基于TIRF显微镜的实时观察系统，直接观察EHBP-1介导的囊泡捕获过程。他们将带有StrepII标签的EHBP-1固定在包被生物素的载玻片上，然后加入装载了荧光标记的RAB-10的人工脂质体。实验结果清楚地显示，只有当RAB-10被非水解GTP类似物GMP-PNP活化时，脂质体才能被有效捕获。这一体外重构实验不仅证明了EHBP-1具有囊泡捕获功能，还揭示了这一过程依赖于RAB-10的活性状态。

在调控机制方面，研究人员通过遗传学筛查发现了一个新的关键分子LST-6/DENND5。通过荧光标记的鸟嘌呤核苷酸MANT-GDP释放实验，他们证实LST-6具有特异的GEF活性，能够促进RAB-10从GDP结合状态转换为活性的GTP结合状态。有趣的是，与已知调控循环运输的DENN-4/GEF相比，LST-6显示出不同的底物特异性和亚细胞定位模式，暗示细胞可能通过不同的GEF来精确调控同一Rab介导的不同运输途径。为了确认这一机制的进化保守性，研究人员转向了人类细胞模型。他们利用RNA干扰技术在HepG2和Huh7肝细胞中分别敲低RAB-10或DENND5的表达。实验结果显示，无论是细胞内还是培养基中的载脂蛋白apoB水平都显著降低，但mRNA水平保持不变。有趣的是，使用溶酶体抑制剂bafilomycin A1处理可以部分逆转细胞内apoB的减少，而蛋白酶体抑制剂MG132的效果较弱，这表明分泌受阻的脂蛋白主要通过溶酶体途径进行降解。

在研究过程中，团队还利用AlphaFold2-Multimer对RAB-10和EHBP-1的复合物结构进行预测，为理解两个蛋白的相互作用界面提供了重要线索。在细胞水平，他们采用spinning disk共聚焦显微镜进行实时成像，发现在EHBP-1缺失的细胞中，RAB-10标记的囊泡呈现出更加活跃的分裂行为，而融合频率保持不变。这一发现揭示了EHBP-1在维持分泌膜区室稳定性方面的重要作用。研究还发现，这一分泌通路具有显著的组织特异性和极性特征。在线虫肠道上皮细胞中，RAB-10-EHBP-1主要调控基底外侧分泌，而对顶膜端分泌没有明显影响。这种极性特异性的发现启发研究人员思考：细胞是否存在多套平行的分泌调控系统？后续，通过系统性筛查分泌相关基因，有助于逐步绘制出一幅较为完整的分泌调控网络图。

在代谢性疾病中，脂蛋白分泌异常是一个普遍存在的问题。通过深入理解Rab介导的分泌调控机制，可能为这些疾病的治疗提供新的靶点和策略。为此，研究团队正在进一步拓展研究，利用光遗传工具研究Rab10活性的时空调控特征，并通过定量蛋白质组学方法鉴定更多的调控分子，为阐明细胞极性运输的基本原理提供进一步的线索，帮助理解细胞内物质运输系统的精确性和复杂性。这一类研究工作也将为理解其他细胞过程提供思路，如在极性细胞中，不同膜结构域的形成和维持可能也依赖于类似的分子捕获机制。在免疫细胞中，细胞因子的定向分泌可能也受到类似通路的调控。随着新技术的不断发展，特别是成像系统、结构生物学方法的进步，以及人工智能辅助的数据分析方法的应用，将有力促进学界对细胞分泌调控机制更深入的认识。

华中科技大学同济基础医学院生物化学与分子生物学系史岸冰、严雁玲为论文通讯作者，博士生刘帅、魏颉为论文第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1083/jcb.202410003

制版人：十一

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