本文学习单细胞转录组分析过程中的标准化、线性降维、非线性降维
五、标准化和降维
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)#这里pbmc从58MB变成349MB了，因为表达矩阵里面原本全是0和1，ScaleData()之后就不是0和1了
pbmc[["RNA"]]@scale.data[30:34,1:3]#查看数据框，发现ScaleData之后就有数字了；至此只能一行内之间的比较了，跨行比较将没有意义
图20
1.线性降维PCA
1.1线性降维
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(pbmc))#尽可能在保留差异信息的同时，也保证了运算速度
# 单细胞数据需要考虑运算的速度和对象的大小，这关系着计算资源是否够用
# 查看前5个主成分由哪些feature组成
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
# 查看以后，可能发现有些基因不在研究范围，如果不想用这个基因，就直接用代码从features里剔除就行，代码如下
# VariableFeatures(pbmc)[VariableFeatures(pbmc)!="MAF1"]或者↓
# setdiff(VariableFeatures(pbmc),c("COA6","MAF1"))#取差集
1.2权重与热图
下面这两个图没什么必要画出来，不过标准流程里面有，所以就写进来了，我们看一下
# 每个主成分对应基因的权重
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")
图21
# 每个主成分对应基因的热图
DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500)#第9张图之后的热图已经比较模糊了
图22
1.3主成分筛选
一般不需要带着太多主成分进行后续分析，太多基因也会拖慢运行速度，所以需要筛选
①方法一
ElbowPlot(pbmc)#选拐点，例如此处7、8、9好像都可以，一般选自己觉得合适的几个数中最大的就行
# 可以用默认值15先做一遍
图23
②方法二
限速步骤：该步骤运行时间较长，所以在此设置：第一次运行这段代码会生成一个文件，当下次我们跑流程跑到这步代码时若检测到我们需要的文件已存在，则跳过这段代码。这样就不会因反复运行而耗费时间了
#方法二 （这个方法比较慢，所以注释掉了）
# 限速步骤
# f = "jc.Rdata"
# if(!file.exists(f)){
# pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
# pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
# save(pbmc,file = f)
# }
# 不过需要注意，这里有pbmc，如果我的pbmc发生改动，这里记得要删掉原Rdata，再重新运行
# load(f)
# JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:20)
如图24，从第1到第13个，p值都是<0.05，所以需要这13个
按照图24来看我们需要选择数字13；而根据图23来看范围可以是7~10左右。如果实在不知怎么选择，就尽可能选较大的数
图24
两个方法任选其一，方法二运行太慢，一般直接用方法一即可
1.4 PC1和PC2 细胞聚类图
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")+ NoLegend()
得到如图25细胞聚类情况，每个点即一个细胞。如果有多个样本，这张图将有不同颜色的点，这样就能看出细胞是否以样本为单位聚成一簇了。我们不希望看到样本与样本之间分得很开，比如样本1即PC1聚成一簇，样本二即PC2聚成一簇，因为这是批次效应导致的
图25
# 结合JackStrawPlot和ElbowPlot，挑选10个PC，所以这里dims定义为1:10
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5) #resolution分辨率范围0~1，分辨率越小，分的簇数量就少（就是看起来越模糊），0.5是折中的值
# 结果聚成几类，用Idents查看
length(levels(Idents(pbmc)))
得到结果9，即分了9类
图26
FindClusters()
之后，每个细胞便有了不同的类别归属，每个细胞属于第几个簇都标好了
图27
2.非线性降维 UMAP 或 t-sne
