神经内分泌：聚焦难治性肿瘤

神经内分泌前列腺癌（ NEPC ）通常意味着严重的致死率和有限的治疗选择。 NEPC 细胞的准确鉴定对机制研究和临床应用都具有重要意义，但有效的 NEPC 生物标志物仍有待确定。今天分享一篇 2024 年 1 月 华中科技大学团队发表在 Theranostics （ IF ： 12.4 ） 的分析文章。该研究为鉴定 NEPC 和 监测 前列腺癌（PCa） 进展提供了一个有价值的工具。

一研究背景

前列腺癌 (PCa) 是男性中第二常见的癌症，影响全球数百万男性。雄激素受体 (AR) 信号通路在前列腺癌的进展中起重要作用，而靶向 AR 信号通路可导致激素敏感性前列腺癌 (HSPC) 的反应。这种疾病经常复发成为一种更具侵袭性的表型，称为去势抵抗性前列腺癌 (CRPC) ，其中大多数仍然被组织学分类为腺癌 (CRPC-adeno) ， AR 通路被重新激活。 其中，约 17% 的 CRPC 表现出不同程度的神经内分泌 (NE) 表型 (CRPC-NE) ，并可能进一步发展为低分化 NE PCa (NEPC) ，这一亚型通常意味着严重的致死率和缺乏治疗选择。

随着患者接受多线治疗， NEPC 的发病率预计会增加。 NE 肿瘤细胞在组织学上可与复杂 PCa 微环境（ TME ）中的其他细胞区分开来；但它们的稀缺性，尤其是在疾病的早期阶段，导致早期 NEPC 经常被漏诊。 目前，NEPC的诊断主要依赖于几种生物标记物的免疫组化：阴性AR、高MKI67和阳性NE标记物。然而，这些蛋白在NE肿瘤细胞中的表达是异质性的，这大大降低了其诊断敏感性。

新一代测序技术的出现为全面描绘 NEPC 分子图谱提供了条件。 NEPC 的关键驱动因素已经确立，如原发性 PCa 中 FOXA1 和 SPOP 的突变、 RB1 缺失和 TP53 功能障碍诱导的系谱可塑性，以及晚期 PCa 中 EZH2 等多聚酶抑制复合体 -2 （ PRC2 ）的激活。 同时，这些研究提出了10多个与NEPC相关的基因集，共包括数千个差异表达基因（DEGs）。然而，这些基因集具有相当大的异质性， 可能的原因包括： a. 这些研究大多基于数量有限的 NEPC 病例； b.CRPC-Adeno 和 NEPC 之间的基因表达谱惊人地相似； c. 这些基因集严重依赖于来自大块肿瘤而非 NE 肿瘤细胞的转录组数据。 因此，为了基础研究和临床转化的目的，仍然迫切需要开发敏感而特异的 NEPC 标志物。

在本研究中，作者首先收集了大量人类 PCa 的 scRNA-seq meta 图谱，发现已发表的 11 个 NE 基因集一致性差、作用力弱。 为了生成更好的NEPC预测因子，开发了一个综合管道，将bulk转录组数据、scRNA-seq数据和多种算法结合在一起，确定了771个高质量的NEPC特征标记和一个NE细胞内在基因特征，并构建了一个稳健的NEPC风险预测模型 。 通过使用来自人类 PCa 队列和 PCa 实验模型的大量数据集， NEPC 分类器在预测疾病进展为 NEPC 、预后和治疗反应性方面显示出卓越的能力，优于所有已发表的 PCa 预后模型。 NEPAL 模型为精确识别和描述 NE 肿瘤细胞提供了有用的参考。

二主要结果

1.以往的NEPC基因集一致性较低，检测效能较差

作者收集并分析了所有 11 个已发表的 NE 标记基因集，包括 9 个来自 bulk 转录组数据的 NEPC 基因列表、 1 个来自正常前列腺 scRNA-seq 的基因列表和 1 个来自 MSigDB 数据库的代表性泛前列腺肿瘤基因列表。 这11个基因集共包含1482个表达上调的NE标记（NEPC_Meta）。然而，这些基因集之间的重叠率很低，只有61个基因重叠了四次以上。

为了评估这些 NE 标记物的灵敏度和效率， 作者根据已发表的9个人类PCa scRNA-seq数据集（图1A），生成了一个全面的scRNA-seq参考图谱， 其中包含来自 66 个 PCa 肿瘤的 210,879 个单细胞，涵盖原发性 HSPC （ Pri ）、 CRPC 、 mCRPC 和 NEPC 。通过相应的生物标记物共确定了 15 种细胞类型， 然后计算了每个样本中NE肿瘤细胞的频率（图1B）。 研究发现这些 NE 标志物（ 894/1482 ）中有一半以上并不只在 NE 肿瘤细胞或具有 NE 特征的患者中表达（图 1C ）。至于上述 61 个重叠率较高的基因，尽管它们能很好地鉴别 NEPC 肿瘤，但一半以上（ 41/61 ）的表达丰度较低（在所有 NE 肿瘤细胞中的表达百分比低于 20% ）（图 1D ），这意味着它们的效率较低。 最后，通过使用AUCell富集分析计算各基因集的NE评分，结果证实了大多数基因集在scRNA-seq数据中识别NE肿瘤细胞的特异性较低（图1E）。 这些结果表明，已发表的 NE 基因集的一致性较低，识别能力较差。

图 1. scRNA-seq 分析显示已发表的 NEPC 基因集合灵敏度低、效率低

2.基于scRNA-seq和bulk RNA-seq meta数据库构建NEPC分类器

为了鉴定高质量的NEPC特征标记，作者设计了一个包括上述已发表的NEPC_Meta标记、基于bulk RNA-seq的PCa WGCNA基因模块和本研究PCa scRNA-seq meta图谱的计算管道（图 2A）。 最后，确定了 587 个上调和 184 个下调的 NEPC 特征基因，统称为 NE_FG （图 2B ）。由于侧重于癌细胞固有基因表达的特征被认为在临床上更有用， 作者 还将 NE_FG 与 NE 肿瘤细胞的 DEGs 重叠，得到了两个 NE 细胞固有基因特征，分别称为 NE_UP （ n = 90 ）和 NE_DN （ n = 40 ）（图 2 C ）。所有 NE_UP 特征基因都具有较高的表达丰度（所有 NE 肿瘤细胞的表达百分比均大于 20% ）。

图2. 基于scRNA-seq和bulk RNA-seq meta数据库，结合多种策略鉴定NEPC标记

为了进一步构建NEPC预测模型，作者对训练集应用了7种基于NE_FG的经典机器学习算法。此外，还基于ssGSEA算法构建了结合NE_UP和NE_DN的NE_UP_DN模型。 随后，利用这些 NEPC 预测因子计算了 6 个 NEPC 肿瘤队列中每个样本的 NEPC 风险评分。在评价指标方面， 作者 计算了每种算法的平均 C 指数（图 3A ）和 R2 。在这些模型中， NE_UP_DN_ssGSEA 、 Enet [α= 0.01] 和 NE_UP_ssGSEA 排在前三位，它们的 ROC 曲线下面积也很高（ AUC > 0.90 ，图 3B ）。此外，除 RSF 和 GBM 模型外，大多数预测因子与 NEPC 预测得分的皮尔逊相关系数都很高（图 3C ）。 根据 scRNA-seq meta 图谱，大多数算法在预测 NEPC 风险评分与 NE 肿瘤细胞的细胞分数之间显示出较高的相关 性 （图 3D ）。 作者还通过六个验证数据集计算 AUC指数，将该模型与已发表的11个NEPC_Meta基因集进行了比较，模型一致优于之前的 NE基因列表（图3E）。

为了进行验证，作者选择了最佳分类器NE_UP_DN signature，并在scRNA-seq meta图谱和另外三个scRNA-seq验证集和空间转录组数据集中评估了其预测性能： a. 基于 Smart-seq2 的 scRNA-seq 数据集； b. 基于荧光激活细胞分选（ FACS ）的单细胞数据集； c. de novo NEPC 与 HSPC 共存的空间基因表达图谱。结果显示， NE_UP_DN 与 AUCell 算法在所有验证集中都能精确预测 NEPC 细胞状态（图 3F-G ）。 综上所述，本文的模型可以根据bulk和单细胞来源的转录组数据，稳健地区分具有NE特征的肿瘤。之后作者使用NE_UP_DN特征进行了后续分析，以下称其为NEPC算法（NEPAL）。

图3. 人工智能开发NEPC风险预测模型的构建与验证

3.利用NEPAL来描绘PCa进展的路径

除了区分NEPC外，作者还假设NEPAL可以量化NEPC的进展，因为它将上调和下调的NE细胞内在特征基因都纳入了模型。为了评估这一假设，作者首先对scRNA-seq meta图谱中的21,526个NE肿瘤细胞进行了重新聚类，从而确定了8个NEPC亚群（图4A-B）。 这些亚群中 CHGA 、 SYP 、 ENO2 和 NCAM1 等经典的 NE 标记物均呈异质性表达（图 4C ）。采用 AUCell 算法的 NEPAL 在所有 NEPC 亚簇中几乎都有表达（图 4D ）。接下来，对 8 NEPC 亚簇进行了伪时间和 CytoTRACE 分析（图 4E-F ），其进化轨迹与 NEPAL 风险评分高度相关（图 4G ），表明其在预测 NEPC 进展方面的实用性。 作者还 发现 PCa 表达谱 中的 NEPAL 风险指数与伪时间评分之间存在显著的相关性 ( 图 4h) 。此外， 作者 在 TCGA-PRAD 、 CamCap 、 ICGC -PRAD 和 CPGEA 四个独立数据集中检查了尼泊尔风险指数与 Gleason 评分之间的关系。 总的来说，这些结果表明NEPAL可以用于预测NE前列腺癌的疾病进展。

图4. NEPAL描绘PCa进展的路径

4.NEPAL在PCa实验模型中的应用

为了验证其实用性，作者进一步将NEPAL应用于PCa实验模型的转录组图谱。 对于来自 CCLE 的 8 个人类 PCa 细胞系， NEPAL 准确地 为 NEPC 细胞系 NCHI-H660 分配了最高的 NEPC 风险分值。 DU145 、 22RV1 和 PC3 等 CRPC 细胞系紧随其后，而 MDA-PCa-2B 和 LNCaP 等激素依赖性细胞系的 NEPC 风险得分最低。此外， 作者 还观察到 NEPAL 评分与 CHGA 和 SYP 等 NE 经典标记物之间存在较高的皮尔逊相关系数。

同时，作者将NEPAL应用于从2个人类 PCa PDX肿瘤和3个PCa转基因小鼠模型中生成的bulk转录组数据集。 PDX 数据库（ UW/RA ）包含 128 个人类 PCa 肿瘤的转录组数据，其中包括 87 个 CRPC 和 41 个 PDX 肿瘤。 在PDX肿瘤中，NEPAL评分与AR/NE状态的演变密切相关（图5A）。 同时，还观察到预测的 NEPC 风险评分与 NE 标记物之间存在较高的皮尔逊相关系数（图 5B ）。在一个独立的 PDX 队列中也多次检测到类似的关联（图 5C-D ）。这一现象并不局限于人类 PCa ， NEPAL 在两个小鼠 PCa 数据集中也显示出了一致的表现（图 5E ）。最后， 根据 小鼠 PCa 模型 RNA-seq 数据集， NEPAL 在预测 NEPC 状态方面再次表现出卓越的准确性， 表现出 显著的生存分层（图 5F ）。 这些结果增强了NEPAL鉴别NEPC的能力。

图5.通过人类 PDX 数据集和小鼠模型验证NEPAL

5.NEPAL的预后价值和生物学相关性

为了评估NEPAL模型的预后价值，作者收集了12个独立的bulk转录组数据集，包含2000多个人类PCa样本，其中10个数据集具有可用的预后信息。作者观察到NEPAL能有效地对HSPC的生化复发（BCR）和晚期PCa患者的总生存期（OS）进行分类（图6A-C）。 此外，根据现有的治疗信息，包括激素治疗、化疗和第二代 AR 信号抑制（ ARSI ）， NEPAL 还能可靠地预测化疗和 ARSI 的耐药性。在 SU2C 、 UM/SPORE 、 MCTP 或 CPGEA 队列中，未接受过治疗组和接受过治疗组的 NEPAL 评分无明显差异，这表明患者之前的治疗史对 NEPAL 模型的预后准确性影响不大。 为了进一步比较NEPAL模型的预后能力，作者收集了20个已发表的预后模型，这些模型均由不同的机器学习算法生成，同时还包括传统的临床参数，如PSA评分、Gleason评分和肿瘤分期。 C 指数显示，在 10 个多中心 PCa 队列中， NEPAL 是比其他模型和传统临床参数最强大的特征（图 6D ），揭示了 NEPAL 模型在预后预测中的稳健性。

同时，在所有数据集中，NEPAL 风险评分与血统可塑性相关通路（如 EZH2、SOX2、NE 分化）的活性以及 RB1、PTEN 和 TP53 信号的缺失明显相关（图 6E）。 此外， NEPAL 风险评分还与晚期 PCa 的几个特征，即 AR-V 、细胞周期进展、 MYC 靶点、增殖和干性显著相关，而与雄激素反应和管腔特征则相反（图 6E ）。 这些结果共同增强了NEPAL预测PCa患者预后、治疗反应性和分子特征的能力。

图6.人类PCa数据库中NEPAL的预后和分子特征

6.TME成分、患者参数和肿瘤分期对NEPAL预测准确性的影响

为了评估TME成分、患者年龄和种族以及肿瘤分期对NEPAL模型预测准确性的潜在偏差，作者对这些因素进行了分层分析。 结果显示， NEPAL 模型在不同的 TME 组别中对患者预后和 NEPC 风险保持了稳健的预测能力。同时， NEPAL 模型还能有效区分不同亚型 PCa 中具有 NE 特征的肿瘤。此外，基于患者年龄、种族和癌症分期的分层分析表明， NEPAL 模型对患者预后的预测能力不受病理因素的影响。 这些结果增强了NEPAL模型在预测NEPC风险和进展方面的普适性和有效性。

7.NEPAL揭示了NEPC的非遗传驱动因素

NEPC的发生和进展既有遗传因素，也有非遗传因素。作者根据NEPAL评分对TCGA PRAD和 SU2C CRPC/Met队列中的肿瘤进行了分层，并分析了它们的表达谱和体细胞突变。 在 PCa 中最常突变的基因中，只有 TP53 在 PRAD 和 CRPC/Met 队列的 NEPC 高危组中比低危组显示出更高的突变率，而 AR 和 RB1 仅在 SU2C CRPC/Met 数据集中的 NEPC 高危组中观察到更高的突变率。此外，在 TCGA PRAD 数据集中，肿瘤突变负荷（ TMB ）和所有基因的突变计数都与 NEPC 风险评分显著相关，而在 SU2C CRPC/Met 数据集中则不显著。 接下来，作者评估了PCaProfiler中1223个组织（包括正常前列腺、原发性PCa、CRPC/Met和NEPC）的基因表达与NEPC风险评分的相关性（图7A）。 编码染色质重塑因子的关键基因，包括 DNA 甲基转移酶（ DNMTs ）以及多聚酶抑制复合体 -2 （ PRC2 ）的成员出现在了前列。对 TCGA PRAD 和 SU2C CRPC/Met 数据集的相同分析也反映了这一观察结果， 支持了表观遗传调节因子在 NEPC 中的关键作用。

此外，基于相关秩的 GSEA 分析表明， NE 分化、胶质母细胞瘤（ GB ）可塑性、 PTEN 缺失、 EZH2 信号传导、 RB1 和 TP53 双敲除上调信号传导（ LNCaP_DKO_UP ）等与细胞系可塑性相关的通路，以及 E2F 靶点、 G2M 检查点和 MYC 信号传导等与增殖和干性相关的通路是最显著激活的通路。另一方面，与 HSPC 相关的通路，如雄激素反应、 IRE1α-XBP1s 信号传导、 SPOP 缺失和 AR 信号传导则受到抑制（图 7B ）。 最后，结合VIPER方法的TF活性推断，作者分别描绘了AR信号、P53和RB1通路以及表观遗传调控等四种与NE转分化相关的通路的信号网络（图7C）。 此外， NEAPL 结合 VIPER 算法鉴定出了与 NEPC 相关的先驱 TFs ，包括以前建立的 TFs ，如 FOXA2 、 ASCL1 和 MYCN ，以及新型 TFs ，如 XBP1s 、 PHTF 、 LHX2 和 NANOS1 。 这些TFs是否以及如何单独或合作驱动NEPC的进展将是未来研究的兴趣所在。

图7.NEPAL对NEPC非遗传进化驱动基因的预测

8.NEPAL: 使用转录组数据预测NEPC风险评分的计算框架

为了方便用户应用，作者 推出了一个 R 软件包 NEPAL ，它集成了本研究中测试的已发表 NE 基因组、用于批量转录组数据的 ssGSEA 算法、用于