Plus推荐 | 拟南芥:植物中PRC2复合体结合的转录因子及识别序列寻找

文 章 内 容

首先，研究者分析了拟南芥数据库中可能被PRC2调控的基因序列，并找到170个候选PREs（按照600bp长度）（Fig.S1）。这其中选择3个基因上的5个候选PREs进行验证，分别是：

AGAMOUS (AG)：AG_1，AG_2

SEPALLATA3 (SEP3)：SEP3_1，SEP3­_2

At5g61120 (At5g)：At5g

如图Figure1 A-B，PRC2组成蛋白FIE、和H3K27me3都能够结合包含有PREs的片段。进一步利用PRE连接GFP和GUS报告系统，也发现以上PREs都能够抑制报告基因的表达（Fig.1C-D）。

Figure S1 PRC2靶点筛选：靶基因和PREs

Figure. 1 验证PREs片段功能：介导PRC2调控

接下来，研究者利用上述5个PREs，连接酵母单杂交系统后，用于筛选拟南芥共计1956个转录因子的库，并找到了233个转录因子能够结合。通过进一步加权分析等，进一步缩减到20个亚家族的55个转录因子。在这些亚家族中，排名最前的三个分别为（Fig.2A）：

C2H2 zinc-finger (ZnF) family（C1-2iD subfamily; 4 of 6 members identified）

植物特异的APETALA2-like family（AP2 subfamily; 2 of 6 members identified）

BASIC PENTACYSTEINE (BPC) family（class I subfamily; 2 of 3 members identified）

利用酵母双杂交分别验证了筛选获得的转录因子和PRC2各个组成蛋白之间的相互作用（Fig.2B-C）；并利用BiFC和Co-IP等手段，进一步验证了部分蛋白之间相互作用（Fig.2D-F）。

验证成功的转录因子举例：TOE1，AZF1，和BPC1等。

Figure. 2 转录因子筛选：能与PREs、和PRC2结合

通过针对上述170个PREs的DNA序列进一步分析，研究者找到了6个motif，分别能够与不同种类的转录因子相结合，包括：CTCC，CCG，G-box，GA repeat，AC-rich和Telobox（Fig.3A-B）。这其中有的motif（如GA repeat和Telobox）已经有报道与拟南芥的Polycomb的分布相关联，再次证实了本文方法的可重复性。继续利用Figure 1A中的报告系统，发现将AG_2和At5g中的Telobox和GA repeat motif分别突变，都会影响PRC2的抑制作用（Fig.3C）。更有趣的是，这些GA repeat在整个十字花科植物中都是保守的（Fig.3D）。

接下来研究者利用凝胶阻滞（EMSA）实验，在体外证明了这些转录因子和相应DNA motif的结合（Fig.3E）：

1）GA repeat和BPC家族的BPC1

2）Telobox和C1-2iD ZnF家族的AZF1

以上研究将PRC2组成蛋白—转录因子—结合的序列即PREs片段直接联系起来。

Figure. 3 PREs的功能发挥需要其上保守的顺势作用元件

研究者进一步分析了PRC2组成蛋白FIE、H3K27me3和以上两个通过EMSA验证过的转录因子AZF1和BPC1在基因组上的结合位点。Figure 4A显示了以上4种蛋白在整体基因组水平上有着共同的定位；选择部分位点详细分析，发现FIE、AZF1和BPC1蛋白的结合PEAK在每个位点上也都比较重叠，而H3K27me3也分布在该位点上以及附近区域内，符合其催化和分布特性（Fig.4B）。定量而言，FIE结合位点中不与AZF1或者BPC1重合的都仅有20%多（Fig.4C）；并且FIE的结合位点中，除去有部分分别与BPC1或者AZF1重合外，还有一大部分与这两个转录因子同时重合（Fig.4D），再次佐证其功能上的相关性和一致性（Fig.4D）。

Figure. 4 ChIP-seq手段分析FIE，H3K27me3，AZF1，和BPC1的结合位点及其之间的关系

为了在植物体内功能水平上验证BPC和ZnF家族等蛋白与PRC2的关系，研究者构建了突变体植物，从体内功能水平上分析蛋白之间功能一致性：

1）clf突变株，即PRC2复合体组成蛋白CLF突变，表现为叶片卷曲、提前开花

2）同时突变BPC和ZnF整个家族蛋白，同样会造成叶片卷曲、提前开花

这些突变体表型上的一致性证明了BPC和ZnF家族蛋白与PRC2复合体的功能一致性（Fig.5A-B）。相应的，ChIP分析也证明突变体中FIE、H3K27me3等的结合会随之下降（Fig.5C-D）；对PRC2靶基因（如AG、LEC2等）表达的抑制减弱，基因表达增强（Fig.5E）。FIE即代表了PRC2复合体在整个基因组、和具体结合位点上的结合也被减弱（Fig.5F-G）。

Figure. 5 BPC和ZnF家族突变与PRC2功能突变表型类似

接下来，研究者分析BPC家族和ZnF家族对于PRC2复合体招募的作用。由于Figure 4中BPC和ZnF同时突变才能模拟PRC2突变的表型，因此将BPC结合位点和ZnF结合位点串联在GUS报告基因的启动子上（如Fig.6A）。PRC2复合体组成蛋白FIE的ChIP结果发现，外援添加ZnF的表达后，FIE的结合上升（Fig.6A）；进一步添加BPC后，结合进一步上升（Fig.6A）。

基于以上结果，研究者绘制了拟南芥（植物）中PRC2蛋白复合体招募和功能的模型，即通过结合BPC和ZnF亚家族转录因子，被招募到含有PREs（如GA repeat motif和Telobox等）的DNA序列上，促进附近区域的组蛋白甲基化（H3K27me3），从而抑制下游蛋白的转录（Fig.6B）。

Figure. 6 BPC和ZnF介导PRC2复合体功能模式

References