怎么办？我的ChIP为何屡屡失败？

我们先来看一下ChIP的实验流程：

ChIP实验是一个研究蛋白质和DNA相互作用的实验，因此，在这个实验中，有三件事情，是最重要的：

• 要维持蛋白质和DNA手拉手的状态（固定交联要恰当）
• 抗体要能够成功识别蛋白质（抗原表位要保护好）
• DNA的检测——下游PCR和测序要能成功（染色质片段化要均一彻底）

ChIP实验的条件是一定要进行优化的，哪些部分需要着重优化和注意呢？

1. 固定试剂以及固定时间

ChIP实验的固定比其他实验的固定要求都要严格。不同的甲醛原料甚至都对固定效果有影响。请不要使用粉末状的多聚甲醛作为原料配制固定液，因为粉末的多聚甲醛会形成不同的多聚体，每种多聚体的固定效率不同，很容易造成重复性的降低。也请不要选择含有甲醇的37%甲醛，甲醇是用以抑制甲醛聚合的，但时间一长甲醇挥发后甲醛就又恢复聚合状态，导致不稳定。推荐大家使用16%甲醛溶液，仅含有甲醛单体，无复合物，可以提供最好的、最准确的固定结果。最推荐的是安瓿包装，即开即用。

请一定对固定时间进行优化！绝大部分实验汪们固定的时间太久了。当然固定时间也不要过短。不同的细胞种类、细胞数量都请使用不同的固定时间。固定时间过长不仅会使蛋白质-DNA聚合物过于紧密，导致片段化困难、解交联困难，还会损伤抗原表位，导致抗体难以成功结合。关于甲醛浓度，可从1%甲醛浓度开始摸索，细胞数量少的话请适当降低甲醛浓度。

*圆圈所指部位是固定过度（20min）后产生的片段化困难的大分子聚合物

*随着固定时间的增长，蛋白对IgG的非特异性结合显著升高

2. Shearing buffer中的SDS浓度

高浓度的SDS对抗原表位的损伤很显著。请选择低SDS浓度的Shearing buffer（0.1%或更低）。抗原表位负责与抗体结合，对免疫共沉淀的成功至关重要，需要认真保护！在IP过程中，SDS的浓度低一些结果会更好。

*随着shearing buffer中SDS浓度的升高，ChIP的富集倍数显著降低。

3. 染色质片段化

不是片段化越彻底，结果就会越好。分布紧密的DNA碎片看起来赏心悦目，上面结合的蛋白却很有可能已经遭受表位受损。使用温控不好的片段化仪器，生物大分子分分钟降解；即使是优秀的温控仪器，长时间的剪切力也会对抗原表位造成损伤。请在抗原表位和染色质片段化效果中找到一个平衡，以达到最佳的实验效果。 特别推荐在片段化后使用ChIP抗体对抗原表位进行验证，在条件摸索阶段尽可能监控更多的步骤，提高实验成功率。

*虽然进行12分钟片段化可以达到更充分的片段化效果，但是western结果显示抗原表位已经开始受损。