▲第一作者：Sayuri L. Higashi、Yanjun Zheng、Taniya Chakraborty
通讯作者：Seraphine V. Wegner
通讯单位：德国明斯特大学
论文doi：10.1038/s41557-024-01682-y（点击文末「阅读原文」，直达链接）
细胞具有非凡的能力，通过激活特定的通路和保留对先前输入的记忆来响应和适应周围环境的变化。细胞分化作为这种适应性的特殊说明而突出。最初相同的多能性细胞逐渐获得新的功能，同时抑制其他休眠细胞。在整个分化过程中，受细胞外环境中各种信号的时序性以及基因网络和翻译后过程中编码的记忆的影响，多能性细胞渐进地执行特定的命运。结果，它们逐渐失去可塑性，首先转变为多能性，最终转变为终末分化细胞，不再响应先前的分化线索。在细胞分化过程中，跨膜信号事件具有中心重要性，因为细胞通过下调同源受体的表达使自身对沿途的信号不敏感。至关重要的是，跨膜信号转导需要高特异性和优先扩增。因此，适应性膜转运，其中跨膜转运随输入的历史而变化，为模拟细胞的分化提供了独特的机会。在此背景下，已报道的基于脂质的合成细胞依赖于通过使用可编程DNA序列的人工基因电路，以及半渗透性底物和/或非特异性转运体(如alpha溶血素)来触发特定的细胞功能。然而，由于缺乏专门的跨膜受体和转运体，不能特异性地运输分子和/或差异激活内部通路，复制特异性和适应性信号传导一直是不可能的。1.本工作通过整合三个休眠的脱辅基金属酶来实现合成细胞的多能性，使它们能够根据特定的金属离子转运与离子载体的顺序分化为不同的命运。2.在第一步分化过程中，本工作选择性地将细胞外3种金属离子辅助因子中的一种运送到多能巨型单层囊泡(GUVs)中，导致细胞内pH升高、过氧化氢产生或GUV裂解。3.之前添加的离子载体由于它们在膜中的相互作用而抑制了与后续离子载体的运输，原子模拟也证实了这一点。因此，第二个离子载体的加入在多能性GUV中引起了减弱的响应，而第三个离子载体的加入没有引起进一步的响应，这与末端分化的GUV类似。4.本工作只选择了3种以Ni2+、Cu2+和Ca2+为辅因子的金属酶作为示范者，但需要不同金属离子辅因子(例如Mn、Fe、Zn、Co、Mo等)或在不同金属离子浓度范围内被激活的金属酶同样为合成细胞中的金属调控打开了可能性。考虑到其中一些金属离子是生物或重金属毒素中重要的第二信使，金属调控也可能导致在生物医学和生物修复中的应用。图1. 具有选择性金属离子转运的多能性合成细胞的设计1、在这项工作中，本工作展示了基于多能巨型单片层囊泡(GUV)的合成细胞中不同酶促反应的选择性和适应性激活。特别地，本工作依靠三种不同的金属离子--Ni2+、Cu2+和Ca2+-作为外部信号，通过特定的离子载体选择性地运送到GUVs中。2、随后，这些金属离子利用这些金属离子辅因子差异激活apo-金属酶。根据激活的特定酶促反应，合成细胞表现出不同的行为，如细胞内pH升高、过氧化氢(H2O2)产生或细胞裂解。离子载体作为细胞命运的决定因子，作为第一个被激活的酶决定了合成细胞的命运，并抑制了随后其他途径的激活。因此，由特定的金属离子运输诱导的第一步分化是确定的，赋予了合成细胞特殊的能力，同时也失去了休眠潜力(图1a)。3、本工作利用共聚焦荧光显微镜监测了外部添加的带有离子载体A、B或C的Ni2+、Cu2+和Ca2+离子进入GUVs的转运情况(图1c)。Rhod2本身没有荧光，但与Ca2+络合后([Ca2+-Rhod2])具有荧光，当重金属离子如Ni2+或Cu2+存在时，这种荧光被猝灭。加入离子载体A后，GUVs中[Ca2+-Rhod2]的荧光降低，而加入外层Ni2+离子后，GUVs中[Ca2+-Rhod2]的荧光无明显变化。4、离子载体A、B和C的最适浓度分别为20 µM、5 µM和1 µM，除非另有说明，在整个研究中使用这些浓度。每个离子与其对应的离子载体的转运是快速的，在平板读数仪测量中(图1e)，在加入离子载体的5~10 min内观察到Rhod2荧光的变化，并在显微镜下观察到单个GUV的水平。总的来说，这些发现证明了离子载体A对Ni2+，离子载体B对Cu2+和离子载体C对Ca2+运输进入GUVs的高选择性，其他金属离子被排除。图2. 在合成细胞中通过金属离子转运激活脱辅基金属酶1、接下来，本工作旨在将每个金属离子的选择性运输转化为GUV中不同酶活性的激活。为了实现这一目标，本工作提出了封装休眠的脱金属酶，这些脱金属酶在与它们的同源金属离子辅因子结合后变得具有催化活性。接下来，本工作通过选择性金属离子转运来评估GUV内部每个脱辅基金属酶的激活情况。2、在装载了脱辅基脲酶的GUVs中，共封装的荧光pH指示剂8-hydroxy-pyrene-1,3,6-三磺酸三钠盐(HTPS)。脲酶传感器在膜渗透性底物尿素和外部Ni2+离子的存在下，最初的荧光较低，在20 min内观察到(图2a)。3、加入离子载体A后，由于Ni2+离子进入GUVs，激活脲酶，产生氨气，使内部pH升高，脲酶传感器的荧光增强。通过对同一GUV随时间变化的跟踪(图2b)，以及对20 min后GUV种群的分析，发现在20 min内，GUV内的pH从7.4上升到9以上。值得注意的是，本工作观察到，由于内部pH和渗透压的升高，很少有GUVs变形，甚至形成相互连接的囊泡，这在之前的一些研究中也有报道。4、为了证明apo-GaoA在GUVs中通过Cu2+转运而被激活，本工作将apo-GaoA、半乳糖(膜不透性)和辣根过氧化物酶(HRP)装载到GUVs中，而Cu2+和Amplex red存在于外部溶液中(图2c)。孵育20 min后，从Gao A传感器(表现在绿色; H2O2氧化无荧光的Amplex red(膜透过性))到HRP催化的荧光试卤灵(膜不透性)，GUVs的内部荧光没有显著增加。然而，当离子载体B启动Cu2+转运后，GUV中Gao A传感器的荧光信号在20 min内增加(图2d)。另外，群体水平的分析和化学发光法检测H2O2进一步证明了加入离子载体B后Gao A活性增加。1、接下来，本工作研究了在具有多个休眠酶的多能性合成细胞中，单个金属酶的选择性激活是否可能。为此，本工作用所有三种脱辅基酶装载GUVs，并通过使用相应的离子载体来评估是否可以用环境中存在的所有三种金属离子激活一种特定的酶(图3a)。这些GUVs还包含脲酶传感器和Gao A传感器所需的成分，以及所有封装和外部添加的底物。2、在加入Ni2+选择性离子载体A后，本工作观察到来自脲酶传感器的荧光信号增加，导致宿命A，其特征是多能性合成细胞(图3b,c)内部pH升高。同时，Gao A传感器的荧光没有增加，GUVs保持稳定，表明脲酶的选择性激活，而不是其他酶。相反，当在多能性GUVs中加入Cu2+选择性离子载体B时，只有来自Gao A传感器的荧光信号增加，而不是来自脲酶传感器的荧光信号增加，导致命运B，其特征是产生H2O2(图3d、e)。3、值得注意的是，在GUV内部GaoA传感器信号的逐渐降低和后期背景的增加可能是由于GUV内部的试卤灵光漂白和囊泡外酶的残余活性以及Amplex red对试卤灵的非催化光氧化。最后，在多能性GUVs中加入Ca2+选择性离子载体C后，GUVs会随着时间的推移而破裂，其特征是由于PLA2的特异性激活导致GUV裂解。4、为了实现这一点，本工作首先考察了顺序添加离子载体对其特定金属离子传输的影响。如前所述，离子载体A基于[Ca2+-Rod2]荧光的猝灭将外部Ni2+离子转运到GUVs中，定义为100%(图4a)。然而，当GUVs先暴露于离子载体B或C 20 min，然后暴露于离子载体A时，Ni2+离子的相对离子传输分别下降至31%和45%。5、与单独加入离子载体B (图4c,d)相比，预先加入1个(A或C)或2个离子载体(或A后C ,或C后A)，所有情况下的相对转运量均降低至25%以下。同样，离子载体A和B的加入对Ca2+向离子载体C的GUVs转运产生了负面影响，表现为[Ca2+-Rod2]荧光的增加(图4e)。与先加入离子载体C相比，提前加入1个(A或B)或2个离子载体(A再B,或B再A)，所有情况下的相对转运量均降低到50%以下(图4f)。因此，离子载体加入的顺序决定了哪些金属离子进入GUVs以及在多大程度上，并且在三种情况下，预先加入一个离子载体都会抑制与后续离子载体的运输。图6. 通过连续添加离子载体实现多能性GUV的差异激活1、为了获得GUV膜内离子载体之间相互作用的更好的分子图像，并了解它们如何对彼此的活性产生负面影响，本工作对POPC双层中的所有三种离子载体进行了分子动力学(MD)模拟。从膜内所有三个离子载体的质心(COM)的z坐标的时间演化可以看出，在2000 ns的模拟时间内，离子载体A和B在两个小叶之间进行了多次转换，尽管离子载体B比离子载体A(图5a,b)发生了更多的转换。2、有趣的是，当离子载体A靠近头部基团时，其取向与膜表面平行，而在脂质双分子层内部则是正交的，推测允许通过膜运输，而离子载体B则没有这种择优取向。此外，离子载体C在相同的2000 ns的模拟时间内没有观察到转变(图5c)。离子载体C的跃迁可能在更长的时间尺度上发生，但在计算时间方面变得过于苛刻。然而，在这些模拟中，人们可能会研究离子载体C对脂质双分子层中其他物种的影响。3、对于(A-A , A-B和A-C)的所有三个两两相互作用，径向分布函数(RDF)在1 nm附近显示出相当大的偏离，这与同一小叶内离子载体之间的相互作用一致(图5h)。然而，这种差异并不明显，需要更长时间的模拟，包括对不同的相互作用模式进行平均，以获得RDF的完全收敛行为。除了A-A对在~2.2 nm处的峰外，只有在1 nm以外的弱相互作用，这对应于特定的边-边结合，其中每个离子载体A位于不同的小叶中(图5h)。4、加入离子载体A后，由于内部pH的增加，脲酶活性传感器的信号在20 min内增加，即命运A (图6a-d)。根据第2次加入哪种离子载体，GUVs的后续响应不同。如果再加入离子载体B，Gao A传感器的信号略有增加，说明H2O2的生成量较低，将其归为命运A-b(图6a,b)。5、当将离子载体C作为第三个离子载体添加到这些GUV中时，没有进一步的变化，代表了一种对进一步输入无反应的末端分化的GUV。相比之下，如果再加入离子载体C，则不会引起Gao A传感器的响应，GUVs也不会发生裂解，但通过释放负载的sulfo-Cy5(以橙色表示)，观察到由于PLA2的部分活化，GUVs变得泄漏，从而导致了A-c(图6c,d)的命运。随后，加入离子载体B作为第三种离子载体并没有激活Gao A的活性。6、如果先加入离子载体B而不是离子载体A，多能性GUV的结果则不同。此时，由于Cu2+被转运到GUV中并激活了Gao A，使得Gao A传感器的信号迅速增加，从而产生了命运B (图6e-h)。如果在第2次20 min后加入离子载体A，脲酶传感器几乎没有增加，则为B-a(图6e,f)。未观察到pH值的升高也可能是由于d-半乳糖醛糖进一步被H2O2氧化成相应的酸。此外，在这种情况下，离子载体C作为第三个离子载体的加入对GUV稳定性和膜渗透性没有影响。相反，如果在离子载体B后第2次加入离子载体C，GUVs由于残留的PLA2活化而发生泄漏，导致命运B-c(图6g,h)。https://www.nature.com/articles/s41557-024-01682-y
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