大规模抗体生产中的反应器放大策略

近日，华人抗体协会与《药学进展》联合精心打造的抗体药专辑终于付梓出版了，协会公众号进行系列转载。这是全文转发这个专辑的第二篇文章，作者是沈阳药科大学马宁宁教授。 前言部分由《药学进展》常务副主编郑晓南和编辑杨臻峥编辑撰写。

抗体药物是未来生物药的主力军，也是创新药研发的重中之重。FDA历年批准的原创新药中，抗体药物所占据的比例越来越高，越来越多的科学家也积极投入到这一研究领域：其受重视的程度可见一斑。近年来，围绕创新驱动国家战略，鼓励创新的政策密集出台，制度改革不断释放发展红利，中国创新药物研发，尤其是以抗体药物为主导的生物药研发将迎来新的时代。

2017年是抗体药物研发领域极其不平凡的一年。在这一年，专注于搭建治疗性抗体领域全球华人交流合作平台及中国抗体药走向世界桥梁的非营利专业协会——华人抗体协会正式成立并召开了第一次年会；也是在这一年，《药学进展》与华人抗体协会签署了战略合作协议。尽管相隔大洋两岸，未曾有过会晤，但多次的线上对话已让双方加深了对彼此的了解，也凝聚了在努力推进中国抗体药研发进程方面的共识，终于，这本历时半年精心酝酿和策划的抗体专刊在金秋十月如期出版。

此次致力于抗体专刊出版的专家来自军事医学科学院基础医学研究所、沈阳药科大学、上海岸迈生物科技有限公司、美国马萨诸塞大学医学院、SYL咨询公司、南京大学医学院附属鼓楼医院、加州大学洛杉矶分校、抗体工作室有限公司，他们在抗体专刊的选题策划、组稿、撰写直至最终出版的过程中不辞辛劳，付出了大量的时间和精力。《药学进展》特此向他们致以最诚挚的谢意！

抗体专刊的四篇综述，覆盖了抗体产业链从上游到下游的热点话题：美国马萨诸塞大学医学院内科系卢山教授介绍了DNA免疫技术在高质量单克隆抗体诱导开发中的应用进展；抗体工作室有限公司创始人刘跃博士介绍了治疗用单抗的人源化和优化；上海岸迈生物科技有限公司总裁吴辰冰博士综述了双特异性抗体技术及双特异性抗体在肿瘤治疗、炎症治疗和抗病毒治疗中的应用进展；“千人计划”专家、沈阳药科大学马宁宁教授担任此次抗体专刊的栏目主编，策划选题同时，以独到的视角聚焦抗体下游领域，阐述了抗体大规模生产中的反应器放大策略并给予了很好的建议，并邀请到军事医学科学院基础医学研究所沈倍奋院士为抗体专题点评（ 抗体专辑｜抗体药物研发四大看点：创新之路向何方？（Ⅰ） ）。

最后，特别感谢华人抗体协会创始人和会长王守业博士的鼎力支持以及他在促进双方合作中不遗余力的努力。抗体专刊既是华人抗体协会专家智慧的结晶，更是《药学进展》与华人抗体协会相知相识、携手助力抗体药物研发的最好见证！

本周开始，我们将通过《药学进展》公众号陆续推出专刊中的5篇文章，敬请关注！在今天发布的文章中，马宁宁教授将为我们重点介绍抗体药物大规模生产中的反应器放大策略。

(文：郑晓南，杨臻峥)

大规模抗体生产中的反应器放大策略

马宁宁

（沈阳药科大学无涯学院，辽宁 沈阳 110016）

[ 摘要]

反应器放大是大规模抗体生产的关键技术之一。反应器放大的挑战来自两方面，一方面是需要综合考虑多个放大参数，如剪切力、混合、传质等，找到均衡的放大方案，另一方面是需要考虑细胞株、培养工艺、反应器的个性化差异，每个项目的具体限制因素不同。对现有反应器放大研究进行总结，并在此基础上系统地介绍成功的反应器放大策略。

[关键词] 抗体；反应器；剪切力；哺乳动物细胞

生物反应器放大是大规模抗体生产的关键技术，但这个关键技术缺少完整的理论指导，主要依靠经验。常见的反应器放大问题包括细胞生长变缓、活率降低、抗体产量降低、抗体翻译后修饰变化等，造成生产效率降低，甚至工艺放大失败。细胞培养工艺放大的挑战是由多个因素决定的，但根本原因在于哺乳动物细胞对剪切力的高敏感性。哺乳动物细胞体积大，又没有细胞壁，易受剪切力破坏。随着反应器规模的放大，搅拌带来的剪切力相应提高，增加对细胞的威胁。另外2个原因包括：①哺乳动物细胞对生长环境极度敏感，环境的变化，如代谢产物浓度和溶氧等，会影响细胞的代谢调节和信号传递，转而影响细胞生长和生产；②反应器随着体积增加，均一性变差，造成部分区域参数超出控制范围。这些限制条件间互相影响，互相限制，所以必须综合考虑，获得折中方案。

大型反应器从设计到操作，涉及众多参数，可分为三大类，包括反应器设计参数、工艺参数和反应器操作参数（见表1）。反应器放大主要涉及操作参数，如搅拌、鼓泡等，但另外2类参数，也对反应器的成功放大有重要影响，例如搅拌桨选型、气体分布器设计、pH控制逻辑、加料比例等。反应器在设计阶段，就应该有目的地减小工艺放大效应，如：采用圆底罐体以避免死体积；底部的搅拌桨应靠近气体分布器，从而能够有效地将气泡分散到整个罐体；搅拌桨应采用大直径、大桨叶的搅拌桨以保证在低转速条件下有足够的液体混合能力等。大部分工艺参数与反应器放大相关性较小，如温度、培养基组分等，可以在小型和大型反应器中保持一致，但部分工艺参数，如加料比例，往往会限制后续的反应器放大。加料比例如果过大，在大型反应器中会造成跳桨现象，即桨叶打击液面，或者造成大量泡沫，或者需要将搅拌限制在很低的转速。操作参数是与反应器放大直接相关的参数，也是本文重点讨论的内容。操作参数包括搅拌速率、鼓泡速度、碱液添加速度等。

反应器中的剪切力主要来源于鼓泡和搅拌。早在20世纪80年代，人们就发现鼓泡带来的剪切力远远高于搅拌带来的剪切力。Kunas等发现，在一个2 L反应器中，如果没有气泡存在，杂交瘤细胞可以抵抗700 r/min的高转速，表明鼓泡是造成细胞破坏的首要原因。与鼓泡相关的高剪切力范围包括气体出口、气泡上升区域和气泡破裂区域。有研究显示，高气体流速会造成细胞损伤。Zhu等在研究600 L和10 000L反应器放大过程中，发现如果气体出口流速高于30 m/s，骨髓瘤NS0细胞开始凋亡，将细胞保护剂（PF-68）的浓度从0.5 g/L提高至2 g/L没有提高对细胞的保护作用；通过气体分布器中气孔直径和数目的设计，将10000 L反应器的出口流速限制在24 m/s以下，成功实现了工艺放大。气泡破裂时造成的剪切力是反应器中所有操作中最强的。Boulton-Stone等和Garcia-Briones等模拟了气泡破裂过程，发现起泡破裂会带来10000000 W/m ³ 级别的高剪切力，按照湍流波长（Kolmogorv microscale）假设，这样的高剪切对应的湍流波长与哺乳动物细胞直径相当，对细胞有强烈的破坏作用。现代细胞培养基中都包括PF-68。PF-68是一种高分子表面活性剂，可以避免细胞吸附在气泡上，从而保证气泡在破裂时，没有细胞在周围。Trinh等实验显示，当没有PF-68或其他保护剂存在时，每个直径3.5 mm的气泡可以杀死约1050个细胞，而在添加PF-68后，细胞死亡被完全抑制。现代培养基中添加的PF-68浓度在0.5~3 g/L之间。

搅拌是剪切力的另外一个重要来源。搅拌造成的高剪切力区域位于搅拌桨周边，这个区域仅占反应器总体积的10%左右，但70%的搅拌能量在这个区域转化为剪切力，所以搅拌桨区的剪切力会比反应器内的平均剪切力高2个数量级。搅拌造成的剪切力强度主要由3个因素决定：培养基的黏度、搅拌桨的构造和搅拌速率。哺乳动物细胞培养基黏度与水类似，对剪切力影响有限。搅拌桨的选型对剪切力有举足轻重的作用。在同样转速下，不同搅拌桨的剪切力会有3倍的差距。低剪切力搅拌桨，如象耳、螺旋桨的构造特点是倾斜的大叶片。倾斜叶片使得液体沿轴向流动，有利于总体混合，大叶片有利于分散剪切力。在培养基黏度和搅拌桨构造都确定的情况下，转速是决定剪切力强度的唯一因素，转速越高，剪切力越大。

剪切力是液体流动和混合的动力。反应器中的混合分为宏观混合和微观混合。宏观混合指的是反应器内液体的总体流动，以混合时间和搅拌总能耗为衡量指标。微观混合指的是在局部区域的内部混合，以Kolmogorov湍流波长局部能耗为主要衡量指标。宏观混合和微观混合既相关又相互独立。反应器内的总体混合主要依靠宏观混合实现，而细胞损伤主要是由搅拌桨区的局部混合造成的。在反应器设计和工艺放大中，理想的状态是保持足够的宏观混合，但需控制搅拌桨区的局部混合强度。轴向流搅拌桨和大叶片在这方面占有优势。随着反应器体积增加，培养液的均一性会降低，造成反应器内分区现象。在碱液、加料液添加处会有局部积累，如碱液滴加处pH会升高，超出细胞承受范围，加料液添加处也会出现高渗透压区、高营养组分区，分别造成细胞损伤和代谢变化。在远离搅拌桨区会出现弱混合区域，在这个区域内的氧气和营养成分有可能得不到有效补充，代谢产物得不到有效清除，对细胞生长和抗体生产造成不利影响。

剪切力对细胞造成的损伤包括物理损伤和生理损伤。物理损伤为细胞凋亡和破碎，生理损伤包括细胞生长、代谢和抗体表达变化。物理损伤容易测量，可直接检测细胞活率、密度，或细胞内物质（如乳酸脱氢酶）的释放。对于悬浮哺乳动物细胞，造成细胞物理损伤的剪切力范围在6000000~200000000 W/m ³ 之间。生理损伤则需依靠更精密的手段。Godoy-Silva等第一个系统地研究了剪切力对细胞生理的影响，考察了高剪切力对中国仓鼠卵巢（CHO）和NS0的细胞生长、抗体产率、葡萄糖消耗和抗体产品质量（包括抗体聚集体、片段、等电点分布、糖基化和蛋氨酸氧化）的影响。研究表明，CHO细胞在抗体生产中的糖基化对剪切力最敏感。在剪切力的强度不足以影响抗体产量、葡萄糖代谢等时，抗体的糖基化会发生明显变化。在剪切力强度60000 W/m ³ 或更高的条件下，G0糖型的比例下降，而G1和G2糖型的比例上升。Sieck等利用一个2 L反应器来模拟长期高剪切力对CHO细胞的影响，发现了同样的现象，在反应器平均剪切力为400 W/m ³ 时，CHO细胞生产的抗体糖基化发生变化。考虑到反应器中搅拌桨区域剪切力和反应器平均剪切力间会有2个数量级的差别，Sieck等测定的平均剪切力对应的搅拌桨区剪切力约为40000 W/m ³ ，与Godoy-Silva等测量的极限剪切力非常接近。需要指出的是，Godoy-Silva等发现NS0细胞的糖基化对剪切力不敏感，这很可能是因为NS0细胞源自天然的悬浮细胞、浆细胞，而CHO细胞源自天然的贴壁细胞，对胞外剪切力敏感。

二氧化碳积累是反应器放大中经常遇到的问题。氧气和二氧化碳在培养基中的溶解度相差1个数量级，所以供氧和去除二氧化碳会出现失衡。氧气溶解度低，供给速度快，需要的鼓泡强度低。但二氧化碳的溶解度高，所以去除比较困难，需要大量气泡。从均衡氧气供给和二氧化碳去除角度来看，大型反应器应该使用供氧效率较低的大泡，直径在1~3 mm之间。微孔气体分布器的传氧效率太高，在大型反应器中会造成二氧化碳的积累。Gray等的研究显示了大孔气泡相对于微泡气体分布器的优势。他们发现虽然微泡可以满足每毫升21000000个细胞的供氧需求，但其二氧化碳去除能力的不足将细胞密度限制在每毫升2400000个细胞。二氧化碳既是需要去除的代谢产物，同时也是细胞需要的营养物质，以及培养基pH缓冲体系组成部分，过度的二氧化碳去除，会造成pH升高，限制嘌呤和嘧啶的合成。

反应器设计及操作参数间相互影响，呈现出交联和非线性关系（如图1所示）。以搅拌速率为例，其不但影响到剪切力，还影响到从混合时间、气液传质系数（kLa）到系统反馈时间在内的多个参数。在反应器放大过程中，表观参数，如图1中所示的搅拌速率和底层空气流速，在不同反应器中不能直接对比。但是不同的反应器可以通过本质参数进行对比，如剪切力、混合时间等。

反应器放大从本质上就是要在大型反应器中为细胞提供适于生长和生产的环境。成功的反应器放大需要进行两重研究，即：①本质参数对细胞的影响；②表观参数对本质参数的影响。第一重研究是对细胞有足够的了解，了解细胞对各个本质参数的耐受度；第二重研究是对反应器有足够的了解，了解各个操作条件，即表观参数，对本质参数的影响。最终通过本质参数将两重研究联系起来。

3.1 细胞耐受度研究

反应器放大首要依据就是细胞的耐受度。细胞耐受度研究策略如图2所示，在反应器放大过程中，反应器内的环境会逐渐恶化，但是只要环境不危及细胞的生长、生产和产品质量，就可以接受。耐受度范围研究要利用放大/缩小模型，找到细胞所能承受的边界条件，这也就建立了反应器必须遵循的“放大区间”，只要大型反应器的运行能够满足放大区间的要求，成功的反应器放大就有了保障。

图2  细胞耐受度的原则策略

图3显示的是二氧化碳积累对一株特定CHO细胞株影响的研究结果。这个实验利用的是2 L反应器，在工艺的第3天，通过在反应器中添加不同浓度的二氧化碳模拟放大过程中出现的二氧化碳积累，2 L反应器的其他条件（包括pH）都维持原工艺。该实验确定在平均103 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的高二氧化碳溶解浓度（dissolved carbon dioxide）与正常二氧化碳（平均65 mm Hg）和低二氧化碳浓度（平均36 mmHg）相比，细胞生长和抗体生产没有显著差异；最高细胞密度稍低，但在常见实验偏差范围内。这个实验指明研究所用的细胞株可以耐受35~100 mmHg的溶二氧化碳浓度。

图3  二氧化碳积累对CHO细胞生长和抗体生产的影响

图4显示的是利用缩小模型研究剪切力对CHO细胞的影响。缩小模型是一个外接高剪切力微流装置的2 L反应器。2 L反应器用来培养细胞，细胞通过外接环路流经一个微流装置，微流装置能够模拟大型反应器中的高剪切力。对照实验使用的是一个类似的系统，唯一的不同是外接环路上没有微流装置，所以对照实验中的细胞不经历高剪切力。实验发现长期高剪切力（290000 W/m ³ ）对细胞生长、活率和抗体产量都没有显著影响（见图4A），但对抗体糖基化产生了影响，在剪切力高于70000 W/m ³ 时，较复杂的糖型（G1和G2糖型）比例增加，简单的糖型（G0糖型）比例降低（见图4B）。因为糖基化对抗体的体内分布和活性有较显著影响，这样的糖型变化在工艺放大过程中应该避免。对实验研究的细胞株，放大过程中遇到的剪切力应低于70000 W/m ³ 。

图4 高剪切力对细胞生长、存活率、抗体效价和抗体糖基化的影响

3.2  反应器表观参数和基本参数的关联

反应器放大就是在不同体积，甚至不同类型的反应器中，通过控制表观参数，将基本参数控制在细胞可以承受的范围内。表观参数的一部分为设计参数，如挡板的设计、搅拌桨的数目和选型等，在反应器设计和组装阶段就已经确定。放大过程中涉及的表观参数主要是反应器的操作参数，而其中最主要的就是搅拌桨的搅拌速率和气体的鼓泡方式和速率。搅拌速率是对反应器影响最大的参数，除了剪切力，搅拌速率还直接影响到反应器的混合时间、传质和传氧速率，甚至消泡剂的使用量等。

3.2.1  搅拌和剪切力间的关系

前期研究显示搅拌带来的剪切力远远低于气泡破裂造成的剪切力，但搅拌仍能改变甚至破坏细胞。在高剪切力条件下，宿主细胞的代谢、mRNA水平和细胞表面受体表达会改变，抗体的糖基化也会发生变化，所以反应器在放大后应尽量控制剪切力，避免高剪切力带来的细胞和抗体产品质量变化。反应器中的液体流动是湍流，到目前为止其剪切力无法准确测量，也无法准确模拟，所以在过去30多年里出现了多个剪切力替代参数，包括桨叶尖端线性转速、Kolmogorov湍流波长、体积平均能耗（等同于体积平均搅拌功率）等。其中体积平均能耗是最常用的替代参数。体积平均能耗（）可以通过搅拌桨的功率准数（power number， N p）来估算，如公式1所示。

公式1中， P 为搅拌桨输入的总能耗， V 为反应器中液体总体积， a 为与搅拌桨相关的一个常数， ρ 为密度， N 是转速， D 是搅拌桨直径。公式1显示，体积平均能耗对搅拌桨转速和搅拌桨直径很敏感，随着转速和直径的增加迅速增加。反应器中能耗强度最高的区域是在搅拌桨尖端，其最高能耗强度可以达到体积平均能耗的100倍，所以可以用公式2来估算反应器中最高剪切力（最高能耗）强度。

3.2.2  搅拌和混合时间的关系

小型反应器中培养液，即细胞的培养环境，其均一性很容易保持，但大型反应器较易形成分区，造成局部营养缺失或代谢产物积累。混合时间是反应器混合强度的重要指标，混合时间越短，物质传递速度就更快，培养液的均一性就更好。反应器中的混合时间（ Q _m ）可通过公式3拟合：

其中， 代表单位体积平均搅拌功率， D 和 T 分别代表搅拌桨和反应器的直径。公式3显示在反应器放大过程中，混合时间会迅速延长。假设反应器几何参数在放大过程中保持不变，即搅拌桨和反应器直径比（ T/D ）和反应器高径比不变，为常数，公式3可简化为公式4。