癌症患者的死亡主要源于器官的特异性转移，受肿瘤细胞固有特性和微环境外部因素的调控。在转移的中间阶段，循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells, CTCs）从原发和转移性肿瘤进入血液，携带侵袭或转移特征的CTCs可越过毛细血管壁到达远隔部位，引发进一步的病变。过去十年的研究显示，CTCs在预测远程转移、评估预后和监测治疗反应等方面具有重要的临床价值。越来越多研究致力于识别CTCs上的关键分子，研发靶向CTCs的抑制剂，为先进的肿瘤治疗带来新希望。近年来，纳米材料和微流控技术在CTCs富集技术的应用有助于更深入地了解CTCs的表型特征和生物学功能，为将其作为潜在治疗靶点提供实际的临床策略可能性。
今天小编和大家分享一篇由中山大学附属第一医院的研究人员发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF：39.3）杂志上的综述，该综述聚焦CTCs在器官特异性转移中的作用，并特别关注与CTCs相关的分子机制研究和临床干预策略。
一、背景介绍
肿瘤转移因高达超90%的相关死亡率在全球范围内引起越来越多的关注。统计数据显示，转移患者（特别是远程转移患者）的总体5年生存率明显低于被诊断为局部肿瘤的患者。转移是一种复杂的全系统疾病，不仅导致目标器官功能的下降甚至完全丧失，还加剧了肿瘤在各个器官中的破坏力和影响，即更严重的类癌病症。
循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发灶或转移灶脱落进入血液或淋巴系统的肿瘤细胞。自1869年阿什沃斯首次描述CTSs以来，大量研究已明确了CTCs在肿瘤早期诊断、预后评估、精准治疗和药物疗效方面的广泛应用前景。深入了解CTCs的生物学特性以及它们与循环和目标器官微环境的相互作用，有助于促进器官特异性转移，将能够早期预测转移并协助制定临床治疗策略。在这篇综述中，作者系统地总结了CTCs介导靶器官转移的分子机制及其临床应用前景的最新见解，并特别关注CTCs与目标器官在器官特异性转移过程中的相互作用机制以及靶向CTCs抑制转移的潜在临床应用。
图1 循环肿瘤细胞（CTCs）研究进展的时间线
二、CTCs的转移机制
肿瘤转移至特定器官的过程中，早期和后期转移微环境（Premetastatic niche, PMN）的形成是关键步骤。“种子和土壤”理论揭示了肿瘤细胞在特定器官微环境中的定植机制。原发肿瘤释放肿瘤源性分泌因子（Tumor-derived secreted factors, TDSFs）和细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）入血循环前，这些因子作用于骨髓来源的树突状细胞（Bone marrow- derived dendritic cells, BMDCs）或组织细胞，调整远隔目标器官的微环境，为CTC的生存和定植创造有利条件，形成PMN。PMN具有六个关键特征，包括炎症、免疫抑制、血管生成、淋巴管生成、器官趋向性和重编程，促进肿瘤转移和定植。上皮间质转变（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤进展的关键步骤，但其对于肿瘤转移的必要性存在争议。不同癌症中EMT诱导转录因子的效应不同，且它们可以相互补偿，导致EMT抑制并不完全阻断。部分EMT经历的肿瘤细胞影响细胞鉴定，使其必要性仍需进一步研究。EMT触发细胞从上皮向间充质状态转变，赋予其更强的侵袭能力和高转移潜能，与干细胞特性紧密相关。循环癌干细胞（Circulating cancer stem cells, CCSCs）是一种具有干细胞标记的CTCs亚型，具有自我更新和增殖潜力，与高转移风险、短无进展生存期、恶性肿瘤分期和药物抵抗相关。EMT和干细胞标志物的共同表达促进远程转移的成功建立。此外，CTCs的代谢状态与EMT发生相关，表现为激活的糖酵解和差异的代谢途径，与肿瘤的侵袭性增加相关。研究还发现CTCs主要在患者休息状态下生成，与昼夜节律激素有关，这对于深入理解和干预肿瘤转移具有重要意义。
肿瘤细胞脱离原发灶后以CTC或CTC团簇形式进入血液循环。在循环中，各种环境压力导致大多数CTCs凋亡，但CTC团簇相对于单个CTC有更强的生存能力。其体积结构和低氧微环境使得CTC团簇更易定植于远处器官。此外，CTC团簇表现出不同的DNA甲基化，与增殖潜能和预后相关。CTC团簇还可能聚集免疫细胞、血小板和癌相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs），增强CTC的干细胞性、增殖能力和免疫逃逸。在靶器官中停滞的CTC可恢复生长、保持休眠状态或形成休眠微转移病灶，受免疫监视和血供限制影响。CTC与器官微环境的相互作用决定了CTC是休眠还是转移，并调控了休眠和转移之间的切换。休眠机制主要因CTC缺乏基因进展，无法自主生长或传递生长信号。细胞可塑性为控制休眠和增殖之间的切换提供可能性。CTC通过上皮-间质转化（Mesenchymal-epithelial transition, MET）或DTCs形式在新的转移部位定植，维持粘附和干细胞特性。
总结来说，肿瘤转移包括以下过程：首先，在形成转移病灶之前，原发肿瘤或CTCs诱导PMNs，为肿瘤细胞在远处器官中生长和定植提供支持。其次，CTCs经历诸如EMT等变化，以增加侵袭性并应对不同的环境压力，以在循环中存活。此外，转移到远处器官的CTCs可能不会立即形成转移病灶。相反，某些CTCs可能进入休眠状态，然后在有利条件下再次增殖，最终导致转移病灶的形成或肿瘤复发。
图2 循环肿瘤细胞（CTCs）从原发肿瘤脱离并在血液或淋巴循环中存活的过程
三、CTCs的器官特异性
Metmap是目前代表性的策略和在线资源，汇集了来自21种固体肿瘤类型的500多个细胞系的转移配置文件，为研究转移机制提供了重要模型。Metmap数据提示，肿瘤细胞的内在特性是决定转移器官的重要因素，为CTCs的发生和器官特异性转移提供了证据。此外，Flura-seq作为一种原位测序技术，因其高灵敏度和高效率在研究器官向性转移方面显示出潜力。
转移呈现明显的器官特异性模式，同一肿瘤的不同亚型显示不同的转移部位偏好，如乳腺浸润性导管癌和浸润性小叶癌。而具有不同雌激素受体和HER2表达情况的乳腺癌显示不同的转移趋势。尽管原发肿瘤和转移器官的解剖特征在解释器官向性方面起到一定作用，但最新研究更倾向于强调CTCs与其对应转移靶器官之间复杂的信号分子相互作用，这可能在器官向性过程中发挥关键作用。
图3 循环肿瘤细胞（CTCs）在器官特异性转移中的整体视图
四、远处器官转移
表1 不同器官转移之间的显著特征
1、脑转移
大脑作为肿瘤转移的常见地点，受其独特的微环境约束，形成了对侵袭性肿瘤细胞更为严格和特殊的要求。CTCs参与脑转移的过程中，通过在环境压力下的不断演化，获得了一系列独特的分子特性。一些乳腺癌肿瘤在首次转移到大脑时表现出神经干细胞的特征，对大脑微环境更为适应。分子特征的改变包括CD133、CD44、CD44v6、EpCAM等，与大脑转移的发生密切相关。此外，CTCs在循环中或适应大脑微环境的过程中经历了一系列适应性的基因突变和代谢重编程，表现出升高的糖酵解水平、增强的脂肪酸氧化和增加的糖醛磷酸途径。这些变化为CTCs在大脑微环境中的持续生长提供了高能量需求。同时，CTCs穿越血脑屏障（Blood-Brain-Barrier, BBB）的机制也得到了讨论，包括环氧合酶COX2、EGFR配体HBEGF、2,6-醛基转移酶ST6GALNAC5等的参与。星形胶质细胞通过分泌丝氨酸蛋白酶激酶（PAs）改变大脑微环境，抑制肿瘤细胞的生存，但CTCs通过产生高水平的抗PA丝氨酸蛋白酶来对抗PAs的影响。研究还发现一些可能介导CTCs穿越BBB的因子。最后，大脑中的居民细胞也被激活，采取措施阻止CTCs的传播，包括星形胶质细胞通过产生PAs，以及CTCs通过产生抗PA丝氨酸蛋白酶等。
由于大脑微环境的独特性，对侵袭性肿瘤细胞有着更为严格和独特的要求。涉及大脑转移的CTCs通过不断演化在环境压力下获得独特的分子特性。研究发现，具有更强肿瘤潜能的细胞亚群在大脑转移中具有优势。CD44变异同功型CD44v6的过表达与小细胞肺癌的大脑转移相关，可能通过激活EMT过程增强细胞侵袭性。其他特征如EpCAM-CTCs过表达大脑转移标记物，以及RAC1与肺腺癌的大脑转移相关，均揭示了CTCs在大脑转移过程中的分子变化。为在大脑微环境中存活或适应，CTCs还经历了适应性基因突变和代谢再编程。这包括升高的糖酵解、脂肪酸氧化和糖醛磷酸途径。
2、肺转移
肺是多种恶性肿瘤的偏好转移位点，如乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤。其丰富的血液供应为CTCs通过血液轻松转移到肺提供了条件。通过早期分泌多种转移驱动因子（TDSFs），原发肿瘤系统性重新编程肺微环境，并显示释放的外泌体对DTCs在肺中的定植和生长至关重要。一旦通过TDSFs动员和招募到预转移肺，表达VEGFR1和VLA-4的骨髓源性细胞（Bone marrow-derived cells,BMDCs）与纤维连接蛋白相互作用，形成预转移簇并增强MMP-9表达。随后，MMP-9改变微环境，增强SDF-1的表达，形成趋化梯度吸引CTCs进入生态位。肺预转移中的CCL2趋化梯度招募CCR2-阳性的炎性单核细胞，通过产生VEGF支持肿瘤细胞生存。此外，外源因素如LPS介导的肺炎症和细胞外分子（如exosomes和miR-105）也参与肺微环境的重塑。CTCs的分子特征决定其适应性和可塑性，如FADS3上调可增强细胞膜流动性促进CTC扩散，而LT受体表达与较高的肿瘤潜在性相关。此外，ICAM-1和VCAM-1在CTC簇形成和DTCs在肺中生存中起关键作用。
3、肝转移
由于肝脏毛细血管窦易接近和肠系膜循环独特特征，肝脏被认为是结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）最常见的转移部位，同时也是肺癌、胃癌和胰腺癌的常见转移部位。CTCs的类型决定了是发生肝内还是肝外转移。混合CTCs主要介导肝内转移，而间质CTCs更可能导致肝外转移。CTCs的分子特性也可能与肝转移相关，如CD133在肺癌细胞中的高表达与对肝的偏好转移相关。CRC CTCs表达CD110与肝转移相关，其受调控的赖氨酸降解增强了CTCs的自我更新和抗氧化能力，助力其在肝脏中生存和成功定植。在结直肠癌肝转移中，CTCs代谢产物与母肿瘤细胞不同，特别是叶酸生物合成在ROS去除中发挥关键作用。肿瘤源性外泌体通过作用于库氏细胞和肝星状细胞引发肝PMN形成。肿瘤来源的外泌体中的MIF被Kupffer细胞吞噬，诱导其分泌TGF-β，从而导致肝星状细胞过度产生纤维连接蛋白，促进骨髓源性巨噬细胞和中性粒细胞在肝脏聚集。肝脏富含纤维连接蛋白的微环境中，来自胰腺癌的外泌体中的整合素αvβ5能激活Kupffer细胞，诱导其表达促炎症的S100A8和S100P，通过招募MDSCs启动PMN形成。miR-135a5p、miR-25-3p和其他miRNAs通过外泌体调控内皮细胞和肝脏微环境，促进CTCs的肝转移。在肝内转移的过程中，EVs还在促进EMT和诱导血管重塑方面发挥作用。由于肝脏的双重血液供应和较低的窦血压梯度，血行途径是主要的肝转移途径。CTCs在循环中受阻，通过多种机制渗出到肝实质中。总体而言，肝脏转移涉及复杂的细胞和分子交互，这些相互作用决定了CTCs在肝脏中的存活和定植。
4、骨转移
骨骼是许多癌症的主要转移目标，如乳腺、前列腺和甲状腺癌。在骨髓窦的环境中， CTCs较容易定植，引发骨骼破坏和转移性生长。癌细胞通过激活成骨细胞和破骨细胞扰乱正常骨骼稳态，关键步骤是刺激骨吸收和增加骨形成。癌细胞在骨髓中表现骨拟态，释放蛋白质和细胞因子，促进骨骼破坏和新生。该过程形成恶性循环，涉及CTCs、骨髓PMN细胞及其分泌因子。肿瘤源性因子激活骨骼细胞，导致骨吸收和释放生长因子，为肿瘤提供生长空间。血小板通过释放TGF-β和PDGF保护CTCs免受免疫攻击，促进CTCs定植和侵入。PDGF-α过表达可使CTCs获得侵袭性，并与Bcl-2共表达时具有转移潜力。血小板激活引发ATX的分泌，通过整合素αvβ3促进乳腺癌早期在骨骼中的定植。巨核细胞的增加可能影响CTCs的越血管，而器官微环境的选择性压力可能导致CTCs发展出特定器官的转移能力。SDF-1/CXCR4在前列腺癌的骨定植中发挥关键作用，调控CTCs与骨髓内皮细胞的粘附。因此，骨转移涉及多层次相互作用，了解这些过程有助于发展更有效的治疗策略。
图4 循环肿瘤细胞（CTCs）介导大脑、肺、肝脏和骨骼转移的分子特征和机制
五、淋巴转移
淋巴结转移在恶性肿瘤分期中起着重要作用，许多情况下，淋巴结是最先转移的器官之一。一些肿瘤能够引发免疫反应，如黑色素瘤，但大多数肿瘤在淋巴结中诱导免疫抑制微环境，助力其生长和转移。淋巴转移前，CTCs预先调整淋巴结微环境，诱导免疫抑制状态，维持肿瘤的发展。原发癌细胞引起的淋巴结处于免疫抑制状态。VEGF-C可保护肿瘤免受免疫攻击，并减弱特定CD8+ T细胞的杀伤作用。在卵巢肿瘤微环境中，肿瘤产生的PGE2和TGF-β抑制淋巴结树突状细胞，限制T细胞的启动。免疫抑制的T调节细胞在淋巴结中积聚，而B细胞表现出促进淋巴结转移的调节性表型。
VEGF-A/C的分泌可激活淋巴结淋巴生成，导致淋巴网络扩张，同时促进CTCs在淋巴结中的存活，进而推动转移。肿瘤相关的中性粒细胞通过释放特定化学信号，如CXCL1和CXCL8，招募中性粒细胞，进而促使淋巴结转移。CTCs的特性，尤其是表现出间质表型的CTCs，与淋巴结转移密切相关。其他标志物如CD44、CD24209、KRT19、mammaglobin、Survivin、hTERT和Bcl-xL也与淋巴结转移相关。
图5 循环肿瘤细胞（CTCs）介导淋巴结转移的分子特征和机制
六、靶向CTCs的临床应用
实体肿瘤的黄金标准仍是通过手术或活检获取组织进行病理学评估，然而对于无法手术或高风险的患者，非侵入性的液体活检提供了更有价值的信息。当前CTCs液体活检研究主要聚焦在三个方面：捕获CTCs以确定数量、鉴定CTCs表型以评估肿瘤状态，以及分析CTCs基因变异揭示肿瘤异质性。CTCs数量和分子特征的检测可用于预测转移风险、确定临床预后，以及动态评估术前和术后的肿瘤状态。此外，CTCs特征可能与抗肿瘤药物的敏感性和抵抗性相关，为精准医学提供指导。大量研究和临床试验证实，较高的CTCs计数与不良预后和差的治疗效果相关。例如，肺癌患者每7.5毫升血液中的平均11个CTCs与不良预后相关。CTCs计数与IB期LUAD患者生存显著相关，4个以上的CTCs预示着术后不良预后。CTCs计数与NSCLC患者负相关，超过8个CTCs预示着化疗不良预后。CTC被列为乳腺癌预后评估工具，AR-V7在前列腺癌治疗中具有指导作用。CTCs的分离技术经过多代演进，包括基于CTC生物物理特性和免疫磁珠技术等。微流控芯片技术是最新一代，通过EpCAM抗体涂覆的微柱阵列捕获CTCs。CTCs的富集技术的进步使对CTCs与转移的关联有了更深入的认识。作为治疗转移性癌症的关键环节，CTCs具有巨大的精准医学应用前景。各种治疗策略致力于限制CTCs存活，减少转移或抑制疾病进展，包括抑制EMT过程、逆转MET过程和清除血液循环中的CTCs。CTCs液体活检的临床应用前景广阔，虽然部分药物已进行了临床试验，但技术的不断改进仍是未来的发展方向。
图6 靶向CTCs策略
1、靶向EMT/MET过程
在原发肿瘤部位，大多数非侵入性CTCs经历EMT过程，获得迁移和侵袭能力。肿瘤进展中，EMT过程高度动态，导致存在混合E/M表型。EMT同样发生在CTCs中，M+表型CTCs在CTC团簇形成、药物抵抗、疾病进展和转移中至关重要。该过程涉及多种分子，如血小板粘附、TGF-β途径和Foxc1。目前，对EMT或EMT相关信号途径的特异性新药物仍在早期阶段。通过靶向上述分子阻断或逆转CTCs中的EMT过程，降低血液中M+CTCs的比例是拦截转移部位建立的潜在治疗手段。针对免疫和EMT相关的TGF-β/TGF-βR/Smad途径，研究人员已经开发了特异性或非特异性的药物，通过靶向和阻断TGF-β受体来进行肿瘤学治疗。血小板来源的TGF-β是引导CTCs转化为更侵袭表型的EMT过程的重要来源。阻断TGF-β和NF-κB途径特异性地消除了EMT诱导和转移形成。姜黄素和黄酮类化合物是靶向CTCs增殖和转移的潜在药物，它们通过影响NF-κB/MPP途径抑制EMT过程。基因编辑TGFβRII导致EMT过程的逆转和EpCAM+CTCs增加。然而，TGF-β通路的失活触发了ERK的反馈响应，促使CTCs的高侵袭性。联合治疗抗TGFβ和ERK对于靶向CTCs的EMT/MET过程至关重要。
2、破坏CTCs的肿瘤微环境
CTC研究揭示了肿瘤微环境在转移性疾病中的关键作用。TAM2、CAFs和BMDCs等肿瘤相关细胞在维持侵略性肿瘤微环境和CTC的转移表型方面发挥重要作用，而CTC的直接相互作用或分泌因子会加速肿瘤相关细胞向促瘤表型的转变。因此，肿瘤微环境中的细胞组分和因子成为抑制转移的治疗靶点。CAFs通过ECM重塑、代谢调控、血管生成和生长因子分泌在PMNs形成中发挥关键作用。PDGF-BB诱导平滑肌细胞分离并转化为CAFs，通过PDGFRα激活促进原发肿瘤细胞释放CTC。TAMs在肿瘤微环境中是最丰富的免疫群体，其可塑性提供了预防转移的潜在靶点。PDGF-BB-PDGFRβ信号介导TAMs向M2表型转化，有助于CTC进入外周血。抑制PDGF-BB和IL-33能减弱TAMs的转变和CTC的传播。
VCAM1介导CTC吸引肺部巨噬细胞，是肿瘤生存的关键因素。IL-17A与肠系膜CTC的数量正相关，而GM-CSF与之负相关，这通过调节TAMs、CD8细胞的趋化来预防CTC在转移部位的定植。BMDCs通过释放的因子在CTCs到达之前创造了适宜的微环境。VEGFR1的特异性抑制剂能有效阻止肿瘤的转移形成。因此，肿瘤微环境中的细胞和因子为抑制CTC转移提供了多重潜在治疗途径。分解CTC团簇并清除单个CTCs。
3、分解CTC团簇并清除单个CTC
CTCs进入血液后，除了单独存在，还能与其他血液细胞直接或间接相互作用，形成CTC团簇，其结构有助于在循环中存活和转移。因此，直接针对单个全谱CTC或破解CTC团簇是抑制转移的有效策略。已开发多种试剂用于直接捕获CTCs。基于TRAIL和E-选择素的脂质体涂层可特异性附着于白细胞，针对CTC团簇实现显著杀伤。将CTC团簇解离为单个CTC是抑制转移的有效手段。针对特定细胞标志物的治疗可减少CTC的干细胞特征，从而降低肿瘤的生长和转移。
表2 CTCs靶向药物可抑制转移
表3 临床中针对CTCs的癌症治疗
七、未来展望
CTCs在器官特异性转移中扮演关键角色。然而由于技术不够成熟和难以分离，CTC的评估仍然存在挑战。关于未来CTC的临床和转化研究，作者提出了三个重要方向：
1、发展超灵敏的捕获技术，丰富尽可能多的CTC亚群，实现外周血中CTC真实丰度的动态实时评估，同时为开发针对CTC自身的新药物靶点铺平道路。
2、根据不同CTC亚群的表型相似性进行集群分析，筛选出一些规律性和代表性的生物标志物，其异常可能表明器官特异性的转移趋势。
3、深入探讨介导CTC生物行为的信号通路及微环境中细胞成分之间的相互作用，以阐明CTC如何参与器官特异性转移的过程。
虽然与CTC相关的应用仍处于实验阶段，但其在动态监测治疗反应方面的潜力突显了其重要性。CTC成为原发病灶与靶向转移器官之间的桥梁。CTC为癌症生物学提供了宝贵的见解，进一步研究将是在临床实践中充分发挥其潜力的关键。
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