【GeneThinkTank】肺癌液体活检应用特辑——复发监测研究篇

本期为【肺癌液体活检应用特辑】的收官之作，敬请关注下期有关消化道肿瘤的科普文章。

往期回顾

对于液体活检在癌症术后复发监测的应用中，虽然在结直肠癌以及乳腺癌领域都已开展了相关研究，但肺癌领域的研究还比较少。近期，《Nature》上发表了一篇有关早期肺癌患者的前瞻性研究表明，液体活检在肺癌早期术后复发监测方面的应用潜力巨大，本期以此内容与大家共同分享。

利用液体活检技术研究术后血液中ctDNA的动态变化与肺癌复发转移的关系^[1]

研究基础 

乳腺癌^{[2, 3]}以及结直肠癌^[4]相关研究表明，利用液体活检技术进行术后监测，能够早于传统标志物预测癌症的复发

，但是血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）的动态变化与早期肺癌复发转移之间的关系并没有明确。非小细胞肺癌患者术后复发的早期监测以及可能导致转移的亚克隆的发现，能够为抑制肿瘤复发提供新的治疗思路。本研究利用肿瘤特异的进化分析方法分析了100名患者的ctDNA（来自于TRACERx研究^[5]），旨在明确术后血液中ctDNA的动态变化与肺癌复发转移之间的关系。

实验设计 

实验流程如图1，作者发表在NEJM的一篇关于TRACERx研究的文章中，已经对这些患者原发灶的不同区域进行了测序及进化分析，本研究作者就根据肿瘤组织中的进化分析结果定制了血液检测panel（含克隆以及亚克隆的突变），从而便于对不同患者血液中的ctDNA进行动态的进化追踪；对100名患者术前以及复发后的cfDNA(血浆游离DNA)进行提取、NGS方法测序后，对患者血液中的突变情况进行进化分析。

图1. ctDNA进化追踪的研究方法概览

研究结果 

1、 ctDNA的检测结果与早期NSCLC患者临床病理的关系

图2a所示为临床病理和ctDNA检测数据分析热图，TBR指肿瘤含量；Ki67是一个细胞核增殖指数，数值越高，说明细胞增生越活跃，主要用于判断肿瘤的恶性程度，将图2a的结果统计后展现在图2b和图2c中。首先，图2b中所示ctDNA的检出率与患者的病理分型是相关的，肺鳞癌患者的检出率为97%，肺腺癌患者的检出率为71%，其他类型的NSCLC患者检出率为19%；其次，图2c所示ctDNA的检出率与肿瘤组织坏死情况也有关，坏死程度越严重，检出率越高，这或许是由于坏死组织释放到血液中的ctDNA更多导致的。

图2. ctDNA的检测结果与早期NSCLC患者临床病理的关系

2、 克隆和亚克隆的变异在血液检测阳性患者中的分布

根据组织中驱动突变的进化分析结果，将血液中的突变也分为克隆突变和亚克隆突变。图3a 所示为组织中克隆和亚克隆SNV（single nucleotide variation，单碱基变异）在血液检测阳性患者中的分布，蓝色代表克隆突变，红色代表亚克隆突变。46名ctDNA检测阳性的患者中，40名检出克隆突变（94%），27名检出亚克隆突变（68%）;  图3b 所示血液检测结果中，克隆中基因突变频率（VAF）显著高于亚克隆中的基因突变频率。以上结果表明，以克隆中的重要突变作为ctDNA检测阳性的标准，比亚克隆更加灵敏。

图3. 组织中克隆和亚克隆在血液检测阳性患者中的分布

3、 血液中基因突变频率与肿瘤大小的关系

肿瘤大小与血液中ctDNA的基因突变检出率也存在着紧密联系。图4a展示的是克隆中基因的突变频率与肿瘤大小的线性关系。可以看出，肿瘤越大血液中克隆相关基因的突变频率越高，假设1cm³中含有9.4×10⁷个肿瘤细胞，那么通过计算可以得出图4b中肿瘤大小与ctDNA突变频率的对应关系，约326,000,000个肿瘤细胞（对应肿瘤大小10cm³）才能在血液中产生0.1%的突变频率。

图4. 血液中基因突变频率与肿瘤大小的关系

4、血液中ctDNA的动态变化与疾病复发以及术后辅助化疗敏感性的关系

从ctDNA检测阳性的患者中挑选了24名患者，在手术前和手术后分别采集血样，并在术后两年内，每隔3个月采集患者血样，进行动态监测，同时利用影像学手段观察患者体内是否有新的肿瘤出现。结果发现，在14名复发的患者中，有13名患者血液中出现了2个及以上的基因突变，且ctDNA检测到突变的时间平均比影像学结果早70天（10-346天，有的甚至早一年）,说明术后ctDNA的动态监测可以提早预测疾病复发。

CRUK0080患者、CRUK0004患者以及CRUK0062患者（图5a,5b,5c），术后30天即可检测到ctDNA的突变，即使进行了术后化疗，ctDNA的突变频率也并未降低，说明这三位患者对于术后的辅助化疗是有抗性的，且这三位患者在术后一年即表现出了复发的症状。因此，术后ctDNA的检测还可以预测患者对术后辅助化疗的敏感性。另外一名患者（CRUK0013）血液中虽然有2个以上的基因突变（图5h），但在辅助治疗之后，血液中检测不到ctDNA的突变，说明在术后的两年都没有发生复发。以上结果表明，术后血液中ctDNA的动态监测能够提早预测癌症复发，且能够辅助判断患者对术后辅助治疗的敏感性。

图5. 血液中ctDNA的动态变化与疾病复发以及术后辅助化疗敏感性的关系

5、血液中ctDNA的检测结果与复发后转移部位的进化特点一致

CRUK0063患者，肺鳞癌II期，肺部组织检测到的突变情况如图6a所示，术后血液中的检测结果见图6b所示。可以发现，术后从340天开始，连续四次检测到了OR5D18突变（红色方格），而OR5D18属于组织检测结果中的一个亚克隆突变；467天后, CT才检测出椎骨的复发迹象，对椎骨组织中的突变进行分析后发现，转移部位的肿瘤细胞突变与OR5D18亚克隆分支的突变特点一致(血液中的突变也是由蓝红这个分支组成)，因此，推测椎骨部位的肿瘤细胞可能来源于原发灶中含OR5D18的亚克隆。

图6. 血液中ctDNA的检测结果与复发后转移部位的进化特点一致

结论点评 

首先，研究通过对100名患者血液ctDNA检出率的分析，鉴定到影响ctDNA释放的独立因素，如组织分型、组织坏死情况等，并分析了影响ctDNA检出率的肿瘤大小阈值；

其次，研究通过对术后血液的动态监测，发现术后血液中ctDNA的突变情况可以反映复发的可能性以及术后辅助化疗的敏感性；

第三，研究通过对ctDNA的进化分析，发现血液中ctDNA的检测结果与复发后转移部位的进化特点一致，为基于ctDNA的治疗研究提供了一条新的思路。

参考文献

[1].   Abbosh C, Birkbak N J, Wilson G A, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early stage lung cancer evolution.[J]. Nature, 2017, 545(7655):446.

[2].   Beaver JA, Jelovac D, et al. 2014. Detection of Cancer DNA in Plasma of Patients with Early-Stage Breast Cancer. Clinical Cancer Research 20: 2643-50

[3].   Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, Ng C, Hrebien S, Cutts RJ, Cheang M, Osin P, Nerurkar A, Kozarewa I, Garrido JA, Dowsett M, Reis-Filho JS, Smith IE, Turner NC. 2015. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Science Translational Medicine 7: 302ra133-302ra133

[4].  Tie J, Wang Y, et al.2016. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer. Science Translational Medicine 8: 346ra92-ra92

[5].   Jamalhanjani M, Wilson G A, Mcgranahan N, et al. Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer.[J]. New England Journal of Medicine, 2017, 376(22):2109.

本章内容小结

图7. 液体活检应用于癌症患者的全病程管理

泛生子现有的液体活检产品，不仅包括基于NGS技术的多基因检测产品（panel），还包括基于数字PCR技术的基因热点检测产品，全面满足晚期非小细胞肺癌患者靶向药物匹配、预后、耐药及疗效监测的临床需求，从而在各个阶段帮助非小细胞肺癌患者制定精准的个性化治疗方案。此外，泛生子推出了组织和血液配对版产品（18基因组织血液配对版和63基因组织血液配对版），满足患者组织血液配对检测的需求，更加全面的进行临床信息的指导。