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被硬控了，无需离心居然也能纯化外泌体（免费试用）

生物学霸 · 公众号 · 生物 · 2024-10-31 17:03

正文

和导师一对一的沟通每次都让我骤然红温

导师

小王，你外泌体那篇文章返修意见弄好了吗，截止时间不多了。

其它修改意见都弄好了，只剩外泌体的电镜观察一直做不好，可能是提取后的外泌体样品中含有蛋白质、脂质等杂质，影响了后续观察。而且拍出来的外泌体形态也有些怪，可能是离心的条件没摸好。

小王

导师

你可以试试层析法纯化外泌体，可以保证结构完整，也省得你整天霸占离心机，师弟师妹们都抱怨你专横呢

差速离心是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将外泌体从样本中沉淀并纯化出来。该方法提取简单，提取过程中不会引入其它标记物，但操作繁琐，费时费力，而且操作过程中的高速离心可能会导致外泌体结构的破坏。一些生物样本中含有的死细胞释放的囊泡以及血清成分也会让得到的外泌体纯度远远不达标，影响后续的功能研究与鉴定。

如何快速纯化外泌体又尽可能保持其原有结构？可以考虑 ExoPura^® Basic 外泌体纯化柱试剂盒！无需借助离心机，上样后仅需 30 min 即可有效去除样品中蛋白和游离核酸，蛋白去除率在 90% 以上，获得高纯度的外泌体馏分。更适用于澄清度高的非复杂生物样本（细胞上清、牛奶澄清液等）中外泌体囊泡的分离和纯化。好不好用试过才知道，点击下方图片申请试用～

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快速外泌体提纯法实验流程（建议收藏）

纯化操作视频（点击查看）

详细实验操作步骤

一、样品准备

1、单次上样体积：0.5 mL ，上样前平衡至室温。

2、浓缩：建议使用 Umibio 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）【货号 UR52121】、Umibio 外泌体提取试剂盒（乳液）【货号 UR52146】对样品进行 100 倍以上浓缩，或采用超离、切向流、100 kD 超滤等方式，进行 50 倍以上浓缩。

注：谨慎使用超离，可能导致蛋白聚团影响分辨率。

3、推荐 BCA 浓度：含 10% 去外泌体血清的细胞上清粗提外泌体 BCA 浓度大于 3 μg/μL ，无血清细胞上清粗提外泌体 BCA 浓度大于 1 μg/μL，乳液粗提外泌体 BCA 浓度大于 3 μg/μL。

注：ExoPura^® Basic 柱的主要作用为去除蛋白和游离核酸等小颗粒物质，纯化过程会对样本进行一定的稀释，因此应尽量保证样品中有足够多的囊泡。如需拍摄电镜，原样颗粒数浓度建议大于 8.0E + 10 particles/mL。

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二、样品预处理

1、使用推荐方法浓缩样品。

2、过滤：使用 0.22 μm 滤膜去除粗提外泌体中的大颗粒。注：使用 Umibio 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）【货号 UR52121】、Umibio 外泌体提取试剂盒（乳液）【货号 UR52146】提取，经 EPF 柱纯化后的样品无需再使用 0.22 μm 滤膜过滤。

3、准备 PBS：使用新过滤的 PBS（0.22 μm）以避免污染和引入大颗粒，确保 PBS 的温度与柱子相同（18～25˚C）。

注：尽量使用当天新配的经过 0.22 μm 滤膜过滤的 PBS，或采购已过膜的 PBS，避免引入微生物及颗粒物污染。如果使用 4°C 冰箱保存的 PBS 溶液，必须平衡到室温后再用，否则有可能在柱子中引入大量气泡，影响分离效果。

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三、柱平衡与柱清洗

1、实验前确保 ExoPura^® Basic 柱处于 18～25˚C 的操作温度范围内，在达到操作温度范围之前，请勿取下柱盖。

2、先取下顶盖上黑色橡胶帽，平衡气压后，再取下顶盖。

3、将 ExoPura^® Basic 柱垂直安装到铁架台上，将废液收集管（离心管或者烧杯均可）放置于柱下方，以备使用。

4、弃去筛板上方的填料保存液（取下底盖，待填料保存液自然流尽或用移液器吸去）。

5、填料保存液流尽后，使用 PBS 对 ExoPura^® Basic 柱的上室进行 2～3 次洗涤，随后加入 20 mL PBS 清洗柱内填料（可分次加，也可连接适配器，每毫升 PBS 流穿时间约 1.5～2.5 min）。当所有 PBS 都进入柱内，液体将停止流出。

注：适配器的使用方式：绿色适配器上方连接 20 mL 规格注射器针筒。

6、PBS 流尽后直接上样，或加入 2 mL PBS 盖上底盖备用。

注：若使用适配器，待针筒中 PBS 流尽，柱内剩余约 2～3 mL 缓冲液，可取下适配器，等待剩余 PBS 流尽，随即进行上样或加入 2 mL PBS 盖上底盖备用。

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四、外泌体收集

1、上样前准备：使用推荐方法浓缩并过滤样本，准备若干标注好的 1.5 mL EP 管待用。

2、加入 0.5 mL 样品：一旦 PBS 不再流出，立即将室温平衡好的 0.5 mL 样品加至 ExoPura^® Basic 柱筛板上（若样品不足 0.5 mL，用 PBS 补足）。

注：避免在过程中长时间停止柱流，确保囊泡分离效果。

3、流穿 2.87 mL 缓冲液*（空隙体积）：当所有样品都进入筛板，底部出口无液体流出后，加入 2.37 mL PBS ，等待 PBS 流过直至无液体流出。此过程中，共流出缓冲液体积 2.87 mL（0.5 mL 样品体积 + 2.37 mL 缓冲液）

*该体积缓冲液是可丢弃的洗脱液，在含有高比例纯化外泌体溶液流出之前。

注：为准确确定流穿体积，仅加入固定体积溶液，等待其流过直至流动停止。

4、收集外泌体馏分：立即用新的 EP 管准备收集纯化体积，分次在筛板上方加入 0.5 mL PBS，按 0.5 mL/馏分收集 2～3 个馏分（纯度最佳为前 2 个馏分即 1 mL 体积，推荐合并前 3 个馏分即 1.5 mL 体积），每次等待体积流过直至流动停止。

5、过滤外泌体：将收集的外泌体馏分转入 Exosome Purification Filter（ EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3,000 ×g（～6,200 rpm*）离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为过滤的外泌体（注：EPF 柱不可重复使用）。

*为约 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤ 2 mL 离心管）。

6、测定收集产物的颗粒浓度和蛋白浓度。如需要，可使用 100 kD 超滤管对收集产物进行进一步浓缩富集（选做）。

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五、柱再生和储存

1、柱再生：收集到所需体积后，用 10 mL 再生液进行清洗，再用 20 mL PBS 清洗，随后可进行第二次上样。

2、柱储存：如果要储存以备将来使用，先用 10 mL 再生液进行清洗，再依次用 20 mL PBS、20 mL 去离子水和 20 mL 的 20% 乙醇清洗，清洗结束后盖上底盖，倒入保存液（ 20% 乙醇），盖上顶盖密封储存。

注：再生液为碱性，避免再生液清洗后直接添加去离子水或 20% 乙醇来平衡纯化柱，防止树脂床内的盐沉淀并损坏柱。

去离子水清洗可进一步洗去平衡过程中产生的盐，防止盐与 20% 乙醇直接接触产生结晶。

可按每毫升液体流穿需 1.5～2.5 min 估算各步骤清洗时间，避免柱内液体流尽后，填料干放时间过长。

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注意事项：

1、当外泌体馏分用于后续高通量测序或者其他组学分析时，为避免交叉污染，建议使用新柱。

2、再生过程中不可避免会产生盐，盐沉淀影响填料性能，每根柱子重复使用次数建议不超过 5 次。

3、请注意使用过程中勿将柱子从高处摔落或摔打，以免导致柱床碎裂。

4、再生液为碱性，有一定腐蚀性，请务必小心使用！

按照以上步骤，通过采用尺寸排阻技术，根据颗粒的大小，在颗粒通过装有多孔多糖树脂的柱子时对其进行分离，快速、高效获得高纯度的外泌体，适用于从澄清度高的非复杂生物样本（如细胞上清、牛奶澄清液等）中分离纯化外泌体囊泡。宇玫博外泌体提取纯化试剂盒-柱纯化，助你搞定每一次外泌体提纯。

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产品优势

1）低剪切力无损分离：通过重力施加最小的机械应力，保留外泌体完整结构；

2）方便快捷：无需大型设备（超速离心机）上样到获得外泌体仅需 30 min；

3）可重复使用：每支纯化柱重复使用次数可达 5 次；

4）馏分纯度高：有效去除样品中蛋白和游离核酸，蛋白去除率在 90% 以上。

案例展示

ExoPura^® Basic 纯化 293T 细胞上清（含 10% 去外泌体血清）

*样品预处理：50 mL 上清经 Umibio 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）浓缩至 0.5 mL，过 EPF 柱

ExoPura^® Basic 纯化牛奶上清

*样品预处理：50 mL 上清经 Umibio 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）浓缩至 0.5 mL，过 EPF 柱

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内容策划：王丹琦

内容审核：吴军

题图来源：图虫创意