基于中药整体性的红豆杉抗乳腺癌活性成分筛选方法研究

天然产物是抗肿瘤药物的重要来源，红豆杉是珍贵的抗癌植物，全世界有 23 种和 1 变种，其中我国有 4 种和 1 变种，有中国红豆杉 Taxus chinensis (Pilger) Rehd. 、东北红化杉 T . cuspidate Seb. et Zucc. 、西藏红豆杉 T. wallichiana Zucc. 、云南红豆杉 T. yunnanensis Cheng et L. K. Fu 和南方红豆杉 T. chinensis (Pilger) Rehd. var. mairei (Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu ^[1] 。正是由于这个原因，红豆杉在中国是一个受保护的物种。目前，许多地区都在进行红豆杉提取物的研究，但是除了紫杉醇 ^[2] 外，其他的活性成分研究相对较少 ^[3-4] 。

中药药效物质基础是指中药及其复方中发挥作用的化学成分（群），是中药针对某一病症发挥药效作用的物质基础总和 ^[5-6] 。现代药理学研究表明，药物可与细胞膜上的受体、离子通道等特异性结合从而发挥药理作用 ^[7] ，如何快速筛选中药宝库中的活性成分，发现潜在的天然候选化合物，是中药新药开发的关键，也是阐明中药药效物质基础及质量控制的关键 ^[8-9] 。目前，生物筛选联合化学分析作为一种有效工具已被广泛用于研究中药中的生物活性成分，如生物亲和色谱法 ^[10] 、细胞膜色谱法 ^[11-13] 、透析分离 ^[14-15] 被应用于中药生物活性成分的筛选。其中，细胞膜色谱法 ^[16-17] （ CMC ）已被证明是筛选中药中活性成分的有效方法。对于平衡透析方法是基于药物结合的平衡原理，主要是在测定药物游离浓度上有广泛的应用，此方法是研究中药活性成分血浆蛋白结合率的常用方法 ^[18] 。

为阐明红豆杉中的抗乳腺癌活性成分群，本实验采用的中空纤维细胞捕获结合高效液相色谱法（ HFCF-HPLC ）和细胞捕获 - 分散液相微萃取结合高效液相色谱法（ CF-DLLME-HPLC ）来筛选和捕获中药中的活性成分群。 HFCF-HPLC 方法是在模拟细胞自然吸收的情况下，直接测定与细胞结合的成分为活性成分； CF-DLLME-HPLC 则采用逆向思维方式，细胞与中药提取液共孵育，根据不同时间段下，细胞上清液成分的变化间接判断与细胞结合的活性成分。 2 种方法的主要的影响条件得到了优化与筛选。在 HFCF-HPLC 中，利用电镜对中空纤维细胞的内表面进行表征；重现性得以验证；利用他莫西芬与吲哚美辛作为阳性与阴性对照进一步验证该方法的可靠性；通过比较与对照品的保留时间，确定了与细胞结合的化合物的结构。在 CF-DLLME- HPLC 中，考察和优化影响 CF-DLLME-HPLC 的变量因素。结果表明， 2 种方法可以简单、快速地进行中药生物活性成分的筛选和分析。 2 种方法的成功应用为分析中药的生物活性提供新颖、有效和方便的方法，并且可以扩展使用到其他中药活性成分的筛选研究中。

1 材料

1.1 仪器与试剂

LC-20A 系统高效液相色谱设备，日本岛津公司； TDL-80-2B 低速离心机，海安亭科学仪器厂； BC-J80S 通用水套 CO ₂ 培养箱，苏州净化设备有限公司； DF-11 磁力搅拌器，江苏荣华仪器公司； XD5-1B 倒置显微镜，德国 Leica 公司； N-1300V-WB 旋转蒸发仪，日本 EYELA 公司； SB25-12DTD 超声波机器，宁波 Scientz 生物技术有限公司；分析纯试剂，广东光华科技股份有限公司；聚丙烯纤维（ PP ），内径 0.55 mm ，孔隙大小 0.18 μm ，天津膜天膜生物科技有限公司；甲醇和乙腈，为色谱级试剂，购自天津大茂化学试剂厂。

1.2 对照品和红豆杉药材

对照品去乙酰紫杉醇（批号 78432-77-6 ）、云南紫杉烷（批号 1605-68-1 ）、巴卡亭 III （批号 27548-93-2 ）、紫杉碱 M （批号 135730-55-1 ）、三尖杉宁碱（批号 71610-00-9 ）、紫杉醇（批号 33069-62-4 ）、金松双黄酮（批号 521-34-6 ）、浆果赤霉素（批号 CB01468520 ）、脱乙酰巴卡亭（批号 32981-86-5 ），质量分数均≥ 98% ，美国 Sigma 公司；他莫昔芬，批号 H33021583 ，宁波天衡药业股份有限公司；吲哚美辛，批号 H20067683 ， 河北御芝林药业有限公司 。

红豆杉药材，批号 20141121 ，广州市大参林药店昌岗分店，样品经过中山大学药学院生药与天然药物化学实验室杨得坡教授鉴定为红豆杉科（ Taxaceae ）红豆杉属 Taxus L. 植物南方红豆杉 Taxus chinensis (Pilger) Rehd. var. mairei (Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu 。

1.3 细胞株

成年女性乳腺癌 MCF-7 细胞，中山大学药理实验室。用含 10% 胎牛血清、 1% 青链霉素混合液的 DMEM 高糖培养基，于 37 ℃、 5% CO ₂ 培养箱中培养。实验所用细胞均处于对数生长期。

2 方法

2.1 溶液配制

对照品溶液：精密称取 9 种对照品各 1.0 mg 溶于甲醇中，称定质量，超声，溶解，冷却后补足减失的质量， 4 ℃保存待用。

细胞培养用的红豆杉提取物（ TCE ）：精密称取干燥至恒定质量的样品粉末 1 g ，以 200 mL 二氯甲烷超声溶解，滤过，滤液以 200 mL 水萃取，之后以二氯甲烷萃取水层 2 次，收集二氯甲烷层，水浴挥干溶剂二氯甲烷，残渣溶解于 5 mL 甲醇中，再用 0.45 μm 微孔滤膜，最终配成终质量浓度为 400 μg/mL 的溶液供细胞培养实验用。

阳性、阴性对照溶液：将 10 片他莫昔芬片、吲哚美辛片研磨成粉，称定质量，精密称取相当于 1 片的质量，放在 1 个 50 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀释定容至 50 mL ，超声 50 min 。冷却后，损失的体积用甲醇补足， 0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得，分别配成质量浓度为 0.2 、 0.5 mg/mL 溶液。

所有的溶液均在 4 ℃冰箱保存，使用前恢复室温条件。

2.2 CF-DLLME-HPLC 方法

将 MCF-7 细胞按接种密度 5 × 10 ⁵ 个 /cm ² 培养在 6 孔培养板中，置于 37 ℃培养箱， DMEM 培养基培养 24 h 后更换无血清培养基，饥饿细胞 6 h 后，加入 TCE （ 400 μg/mL ）溶液分别培养不同时间（ 1 、 8 、 24 h ），取细胞上清液，待用。

在 15 mL 带盖尖底带塞离心管中加入 6mL 含有中药提取液的细胞上清液，用注射器将分散剂四氢呋喃（ 400 μL ）和萃取剂三氯甲烷（ 60μL ）的混合溶剂迅速注入含有中药提取液的细胞上清液中，超声振荡 0.5 min ，形成均匀的乳浊液，再以 3 000 r/min 离心 10 min ，用 1 mL 微量进样针将沉淀于离心管底部的萃取剂转移到样品瓶中，水浴蒸发有机溶剂，加入 50 μL 色谱级别甲醇溶解，取 20μL 注入 HPLC 分析。所有的实验操作平行进行 3 次。具体操作如图 1 所示。

2.3 HFCF-HPLC 方法

HFCF-HPLC 过程如图 2 所示 ^[19] 。取 5 mL 红豆杉提取液置于含搅拌子（ 10mm × 4 mm ）的样品瓶中。将种有乳腺癌 MCF-7 细胞的中空纤维两端用棉线封口，弯成 U 型，插入上述样品瓶。打开磁力搅 拌器， 37 ℃、 600 r/min 筛选 3 h 后取出纤维，剪掉两端封口，将纤维管内液体打入 2 mL EP 管中，分别用 40 μL 甲醇洗脱与细胞结合的活性成分，并和 EP 管中溶液合并。在 10 000r/min 离心 20 min 后，取上清液（ 20 μL ）进行分析。同时进行对照实验（装有培养液中空纤维筛选）。每组实验平行 3 次。

2.4 色谱条件

TCE 的色谱条件：色谱柱为 Inertsil ODS-SP-C ₁₈ 柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ， Agilent Technologies ），检测波长 227 nm ，柱温 37 ℃，进样量 20 μL ，体积流量 0.8 ～ 1.0 mL/min ，流动相为乙腈 - 水，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，梯度洗脱： 0 ～ 10 min ， 85% 乙腈； 10 ～ 50 min ， 85% ～ 4% 乙腈； 50 ～ 55 min ， 4% ～ 85% 乙腈。

他莫昔芬的色谱条件：色谱柱为 Ultimate AQ-C ₁₈ 分析柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ），检测波长 238 nm ，柱温 37 ℃，进样量 20 μL ，流动相为甲醇 - 水 - 三乙胺 - 醋酸（ 80 ∶ 20 ∶ 0.2 ∶ 0.2 ），用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，等度洗脱。

吲哚美辛的色谱条件：色谱柱为 Ultimate AQ-C ₁₈ 分析柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ），检测波长 228 nm ，柱温 37 ℃，进样量 20 μL ，流动相为 0.1 mol/L 醋酸 - 乙腈（ 20 ∶ 80 ），用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，等度洗脱。

3 结果与分析

3.1 CF-DLLME-HPLC

3.1.1 萃取条件优化 本实验考察了萃取剂种类、萃取剂体积、分散剂种类、分散剂体积对萃取效率的影响，萃取剂选择了三氯甲烷、氯仿、氯苯、二氯甲烷、二氯乙烷；萃取剂体积选择了 30 、 50 、 60 、 80 、 100 mL ；分散剂选择了乙腈、乙醇、四氢呋喃、丙酮、甲醇；分散剂体积选择了 100 、 200 、 300 、 400 、 600 μL 除上述筛选萃取条件优化外，本实验还考察了细胞接种密度以及给药质量浓度对筛选效果的影响，最终确定筛选条件： TCE 质量浓度为 400 μg/mL ；细胞接种密度为 5 × 10 ⁶ 个；萃取剂为 60 μL 氯；分散剂为 400 μL 四氢呋喃。本实验利用 9 种对照品测定保留时间重现性，保留时间 RSD ＜ 0.85% ，说明 CF-DLLME-HPLC 重现性良好，分析结果准确可靠。

3.1.2 CF-DLLME-HPLC 筛选结果 如图 3 所示， TCE 与 MCF-7 细胞共孵育，孵育时间从 1 h 延长到 24 h ，可以观察到活性成分显著变化， 1- 脱乙酰巴卡亭、 2- 巴卡亭 III 、 3- 紫杉碱 M 、 4- 去乙酰紫杉醇、 5- 三尖杉宁碱、 8- 金松双黄酮、 X1 ～ X5 含量逐渐减少。这些化合物可能与细胞相互作用从而可以被视为潜在的生物活性化合物。未知化合物（ X1 ～ X5 ）需要进一步使用色谱、质谱分析和文献对照来确定其可能的化学结构。在整个萃取过程中没有发现三尖杉宁碱，可能的原因是细胞对此化合物的快速吸收导致。 1 h 孵育后， 6- 紫杉醇的含量逐渐降低并且趋于稳定。

3.2 HFCF-HPLC

3.2.1 萃取条件筛选

（ 1 ） 中空纤维的表征：利用扫描电子显微镜观察聚丙烯中空纤维种植细胞后的形态学特征。测试电压： 10 kV 。将中空纤维纵向切开，外露了中空纤维的内壁。图 4 显示了不同放大倍数下细胞种植（空白对照）中空纤维内表面电镜图片，含有培养液的空白对照中空纤维内壁：平滑，毛孔均匀分布，没有任何添加物。图 4-b ～ d 显示了不同放大倍数下种植细胞后的中空纤维内壁：细胞均匀分布，在纤维孔径中健康生长并且覆盖中空纤维表面的空隙中。

此外，通过图 4-c 、 d 可以看出，圆形状的细胞不仅仅是简单的落在中空纤维的孔径中，而是通过 胞间连丝实现了细胞增值生长。细胞生长状态良好，粘连紧密，无凋亡现象，也说明了细胞与纤维之间具备良好亲和性。

（ 2 ） 搅拌速度与筛选时间的选择：为了使红豆杉中的活性成分在样品相与细胞接受相间达到筛选平衡，实验考察搅拌速度与筛选时间对目标分析物的萃取效率的影响。结果发现，随着搅拌速度的增加，有效成分的转运增强，但是过大的搅拌速度对细胞带来了不可逆的损伤。最终选择 600 r/min 。在 600 r/min 搅拌速度下，实验分别对不同筛选时间进行优化。结果显示筛选 1 h 模型组与空白组没有显著性差异，随着筛选时间的延长，结合作用持续增强。筛选时间 3 ～ 4 h 的筛选结果相当，最终确定的筛选时间为 3 h 。

（ 3 ） 活性成分与聚丙烯中空纤维之间的非特异性结合：为了验证方法的准确性，首先必须证明所用材料与活性成分之间没有或有很微弱的非特异性结合。利用空白中空纤维（纤维内装培养液同步筛选）对中药化学成分进行筛选，然后观察色谱行为的特征。由图 5 可见，空白中空纤维筛选的结果：色谱行为变化很小，说明中空纤维与活性成分之间存在微弱结合能力，可以忽略不计。细胞中空纤维在中药提取液中作用后给出的活性成分信息是细胞与化合物相互作用的结果，中空纤维在此过程中只 起承载和保护细胞的作用。