DOI: 10.1016/S1872-2067(20)63744-5
近日，《催化学报》在线发表了南京大学鞠熀先教授、周俊副教授团队在DNA模拟酶领域的最新研究成果。该工作报道了G-平面完整性对G-四链体/hemin DNA模拟酶催化重要性的研究。论文共同第一作者为：陈杰林和程明攀，论文共同通讯作者为：鞠熀先和周俊。
DNA模拟酶由于其设计性强、稳定性高、生物相容性好等优点而广受关注，G-四链体（G4）-hemin DNA模拟酶就是其中的明星DNA模拟酶之一。
然而，G4-DNA模拟酶的进一步发展和应用往往受限于其较低的催化活性以及不明晰的催化机理。
目前，研究者主要将注意力集中于G4-DNA模拟酶活性的增强，而对G4与hemin之间的相互作用却研究甚少。
前述研究G4与hemin结合时，发现G4不仅提供末端G-平面与hemin进行π-π堆积作用，而且其末端G-平面上的G碱基可以通过一定的方式（例如G碱基翻转）与hemin的铁中心进行配位，从而充当近端配位的作用，促进铁卟啉催化中间体的形成，实现DNA模拟酶的激活。
为了进一步研究末端G-平面完整性对G4-DNA模拟酶的重要性以及末端平面上的G碱基是否能与hemin进行配位。作者们设计了一系列含有空位的G4结构（GV）以及G-三链体（G-Tri），考察末端G-平面完整性对G4-DNA模拟酶催化活性的影响。继而通过“鸟嘌呤类似物插入”的策略，验证了完整G-平面对G4-DNA模拟酶活性的重要性。与此同时，通过末端碱基的设计，研究了末端G-平面与末端碱基协同激活DNA模拟酶的过程。
G-平面作为hemin的结合位点，不仅提供大π平面与hemin结合，而且其平面上的G碱基还可以充当近端配位基团与hemin进行配位。
因此，研究其完整性在G4-DNA模拟酶体系中的作用具有重要的意义。
本研究设计了一系列含有空位的G4以及G-三链体，研究末端G-平面完整性对G4-DNA模拟酶活性的影响，并通过“鸟嘌呤类似物插入”的策略实现G-平面完整性以及DNA模拟酶活性的恢复。
通过系统的研究，作者们发现末端G-平面完整性是G4-DNA模拟酶活性的保障，且末端G-平面能够充当近端配位基团与末端碱基协同激活G4-DNA模拟酶。
截止目前，仅有三个含有空位的G4结构（GV）得到了解析，考虑到结构复杂性以及与hemin的结合位点等因素，作何选用了A. T. Phan课题组最近解析的两个序列（GV1和GV2，具体信息见表1）作为起始模型序列。
图1. G-平面完整性对G4-DNA模拟酶活性影响的示意图。上图：含有空位的G4（GV）（此处为GV2的结构，PDB ID为6K3X）可以通过游离的鸟嘌呤类似物（无环鸟苷（A）和鸟苷（G））插入使G-平面完整性得到恢复。下图：G-三链体（G-Tri）与富G序列（TG3T）相结合实现G-平面完整性恢复。
作者课题组和其它研究组的工作揭示G4结构的3’端G-平面与hemin结合力高于5’端G-平面，而GV1，GV2不完整的G-平面也恰好位于3’-端，因此有利于进一步研究G-平面与hemin的相互作用。接下来，作者以GV1，GV2为模型序列，对其末端序列进行改造，并通过鸟嘌呤类似物的特异性结合，实现G-平面完整性的恢复，考察3’-末端平面完整性对G4-DNA模拟酶催化能力的影响（图1，上）。为了进一步考察末端G-平面的影响，作者们设计了G-三链体（G-Tri）与富G单链配对形成（3+1）复合型G4结构，考察两端G-平面完整性对DNA模拟酶的影响（图1下）。
图2. （a）“鸟嘌呤类似物插入”策略实现G-平面完整性恢复。（b）GVs和G4s所形成DNA模拟酶的催化活性。（c）GV1、（d）GV2、（e）GV2A和（f）GV2TC所形成DNA模拟酶与不同浓度鸟嘌呤类似物（无环鸟苷（A）和鸟苷（G））反应后的DNA模拟酶活性（鸟嘌呤类似物的浓度是GVs结构的2、5、20、50和100倍）。
最近的报道揭示有些鸟嘌呤类似物与含有空位G4（GV）之间具有较高的亲和力，例如无环鸟苷（A）和鸟苷（G）与GV2的亲和力可达到μM级别。因此，这两种类似物可以充当G-空位填补剂（图2a）。如图2c和2d所示，随着鸟嘌呤类似物A（或G）浓度的增加（[A]/[GV] = 2 ~ 100），GV-DNA模拟酶（GV1和GV2）的催化活性也逐渐提高，并在[A]/[GV] = 20时达到平台期。相较于GV2，GV1的活性并没能完全恢复至完整G4结构（PG4）的水平，这可能是由于GV1的5’末端附近存在一个T碱基凸起结构，一定程度上阻碍了hemin的堆积以及鸟嘌呤类似物的插入，从而导致活性无法完全恢复。而GV2则可以恢复至与PG4活性基本一致。除此之外，过饱和的A（或G）并不会继续提高DNA模拟酶的催化活性，说明此时G-空位已经得到了填补，也说明鸟嘌呤类似物对hemin和完整G4-DNA酶的催化活性并无影响。
综上所述，这些结果证实了
3’
端
G-
平面完整性的恢复可以使
G4-DNA
酶的催化活性得到恢复
。
接下来，作者在GV2的3’端添加了末端碱基dA和dTC（序列名分别为GV2A和GV2TC）。研究结果发现，GV2A和GV2TC-DNA模拟酶活性高于GV2（图2b）。例如：dA将GV2的活性从31.7增加到108.1 nM/s；dTC将GV2的活性增加到231.4 nM/s。但是，它们的催化活性仍然低于相应的完整G4：G4A（234.0 nM/s）和G4TC（489.0 nM/s）。此时，鸟嘌呤类似物A/G的添加，可以逐渐恢复GV-DNA酶的活性（图2e和2f）。
图3. G-三链体（G-Tri）与不同浓度的TG3T（5、10、20和50倍）结合后的G4-DNA酶活性。
为了进一步说明末端G-平面完整性的重要性，作何设计了G-三链体（G-Tri），使其双端G-平面均不完整，然后再通过富G单链（TG3T，d[TGGGT]）的插入，使其形成（3+1）的复合型G4结构（图1，下图）。如图3所示，G-Tri+TG3T体系的催化活性随TG3T浓度的增加而增强，从19.7（[TG3T]/[G-Tri] = 0）增至50.4 nM/s ([TG3T]/[G-Tri] = 50)，达到与完整G4结构（PG4）活性相当的水平（53.2 nM/s）。以上结果说明，
两端
G-平面的完整亦是G4-DNA模拟酶的保障
。
图4. Holliday junction约束下的G4-DNA模拟酶催化活性。（a）Holliday junction约束下的7个G4结构示意图（HGV和HG4），包括含有（HG4，HG4TC-1和HG4TC-2）、不含有（HGV1，HGV1TC，HGV2和HGV2TC）完整的末端G-平面以及含有末端碱基dTC（HGV1TC，HGV2TC，HG4TC-1和HG4TC-2）的G4结构。（b）含有不完整末端G-平面的G4结构与不同浓度无环鸟苷反应后的G4-DNA模拟酶活性。
接下来，作者通过Holliday junction结构调控形成反平行G4结构，考察反平行结构中，末端G-平面完整性对G4-DNA模拟酶的影响。如图4所示，通过Holliday junction双链的限制，可以使G4形成反平行G4结构。通过末端平面的设计，可以使其形成7种结构：3’或5’末端含有空位的HGV1和HGV2；同时含有空位G-平面和末端碱基dTC的HGV1TC和HGV2TC；以及具有完整末端G-平面的对照组HG4，HG4TC-1和HG4TC-2（图4a）。活性实验结果显示（图4b），当末端碱基dTC不存在时，HGV的催化能力不足：HGV1和HGV2的速率分别为39.0和44.2 nM/s，而完整G4（HG4）的速率为75.4 nM/s。当末端碱基dTC存在于3’端时（HG4TC-1），可以激活DNA模拟酶活性，而5’端（HG4TC-2）时则抑制DNA模拟酶活性。利用鸟嘌呤类似物插入策略处理HGV体系，结果发现，不论末端dTC碱基存在与否，无环鸟苷均无法使GV-DNA模拟酶的活性得到提升。该结果表明，
鸟嘌呤类似物插入策略只适用于平行
G4结构，不适用于反平行G4结构
。
图5. hemin与GV（红色）、结合不同浓度无环鸟苷的GV（绿色）以及与完整G4（蓝色）之间的解离常数（
K
d
）。利用T检验分析完整G4和GV（包括与不同浓度无环鸟苷结合的GV2）与hemin之间的结合力强弱：***表示p < 0.001，即显著性差异。
进一步探究末端G-平面完整性影响G4-DNA模拟酶催化性能的机制，作者考察了不同G4结构与hemin之间的亲和力（图5）。非完整G-平面的存在时（GV1，GV2，GV2A和GV2TC），hemin与GV的结合力远低于完整G4（PG4，G4A和G4TC）。将GV2与不同浓度无环鸟苷（A）相结合后，A可以插入G-空位中，所得的G4结构（GV2+A）与hemin具有较强的结合力，且接近于完整G4。通过T检验分析发现，不论是完整G4（PG4，G4A和G4TC）还是通过无环鸟苷填补形成的GV2+A结构，其与hemin的结合力均显著高于非完整G4（
p
< 0.001）。同时，GV2在A插入后，其结合力也显著性提高，说明完整的G-平面是与hemin结合的保障。综合前面的实验，作者得出结论：
G-平面的不完整直接导致了G4与hemin的结合力下降，并最终影响了其整体的催化活性。
1. 3’-端G-平面的完整性是G4-DNA模拟酶实现其催化活性必不可少的因素，尤其是平行结构G4。
2. 研究发现，利用“鸟嘌呤类似物插入”策略，将鸟嘌呤类似物插入G-空位，可以实现G-平面完整性的恢复，实现G4-DNA模拟酶催化活性的恢复。
3. 末端碱基的存在可以和G-平面形成协同作用，与hemin的铁中心共同形成六配位的关系，加速其催化中间体的生成，增强其催化活性。
尽管DNA模拟酶在生命分析相关领域得到了广泛的应用，但是其催化性能低下，机理不明晰依然限制着DNA模拟酶的进一步应用。G-四链体-血红素(G4-hemin)DNA模拟酶由于其结构具有较高的设计性和化学稳定性而格外受关注。G-平面作为辅酶因子hemin的结合位点，不仅提供大π平面与hemin结合，而且其平面上的G碱基还可以充当近端配位基团与hemin进行配位。因此，研究G-平面完整性在G4-DNA模拟酶体系中的作用具有重要的意义。本研究设计了一系列含有空位的G4(G-vacancy，GV)以及G-三链体，通过“鸟嘌呤类似物插入”策略实现G-平面完整性以及DNA模拟酶催化活性的恢复。研究结果显示末端G-平面完整性是G4-DNA模拟酶活性的必要条件，且其能够充当近端配位基团与末端碱基协同激活G4-DNA模拟酶。
本研究考虑到hemin会选择性地结合于G4的3’端平面，因此以含有3’-端空位的G4以及G-三链体为模型进行DNA模拟酶的构建。实验发现，相较于末端完整的G4-hemin DNA模拟酶，末端不完整的G4结构所形成的DNA模拟酶催化活性很低。为了进一步验证该平面完整性的重要性，我们提出了“鸟嘌呤类似物插入”策略，即将鸟嘌呤类似物(无环鸟苷(acyclovir，A)和鸟苷(guanosine，G))插入G-空位以恢复G-平面的完整性。通过圆二色光谱和紫外熔解实验，我们发现末端平面完整性的缺失会使圆二色特征峰信号和G4结构热稳定性下降，而鸟嘌呤碱基类似物的加入则可以使特征峰信号以及热稳定性得到一定程度的恢复，说明了鸟嘌呤碱基类似物的加入确实使G-平面完整性得到了恢复。与此同时，随着鸟嘌呤碱基类似物浓度的增加，G4-hemin DNA模拟酶活性逐渐增强，最终恢复至与完整G4一样的活性。在以G-三链体为模型的实验中，我们通过另一条富G序列与G-三链体进行结合，形成复合的(3+1)型G4结构，最终实现了DNA酶活性的恢复。与此同时，我们在3’-G-平面末端增加了激活碱基(dA或dTC)，实验发现，即使G-平面不完整，末端碱基依旧能够激活DNA酶，但酶活性整体弱于完整G4时的活性。同样，“鸟嘌呤类似物插入”策略可以使酶活性得到恢复。这一系列实验充分说明了末端碱基可与G-平面形成协同作用，与hemin的铁中心共同形成六配位的关系，加速催化中间体的生成，进而增强催化活性。有趣的是，通过设计Holliday junction结构研究发现“鸟嘌呤类似物插入”策略仅适用于平行G4结构。总之，本研究对理解末端G-平面在G4-DNA酶中的作用，证明了3’-端G-平面的完整性是G4-DNA模拟酶实现其催化能力必不可少的因素。G-空位的存在不仅降低了G4结构的稳定性，而且降低了其与hemin间的亲和力，二者均是造成G4-DNA酶催化能力下降的主要因素。
鞠熀先
，南京大学教授。主要研究方向为：分子诊断与生物分析化学，主要研究领域为免疫分析、细胞分析化学、纳米生物传感和临床分子诊断。
2003年获国家杰出青年科学基金，2007年教育部“长江学者”特聘教授、“新世纪百千万人才工程”国家级人选，2009年为“973”计划项目首席科学家，2011年获国务院政府特殊津贴，现为生命分析化学国家重点实验室主任，国际电化学会会士、英国皇家化学会会士。发表论文731篇 (SCI刊物676篇，>5刊物452篇；其中第一与通讯作者497篇，>5刊物317篇）；专利42件 (26件授权)，中英文专著、教材11部(Elsevier、Springer和RSC出版社4部)，为9部英文和11部中文著作撰写专章各1篇；至2021年1月28日论文被SCI刊物引用33910 (他引32643次)，
h-index
为
95
(
Google Scholar h-index
为
103
，引用39000多次)。
课题组链接：https://cms.nju.edu.cn/hxju/
周俊
，南京大学副教授。主要研究方向为：G-四链体的结构、性质与应用，其它特殊的核酸结构的设计，DNA组装，生物传感。
2010年获中国科学院大连化学物理研究所博士学位，师从李灿院士。2011-2014年在法国国家健康与医学研究院/欧洲生物与化学研究所从事博士后研究，期间获得欧盟玛丽居里学者（Marie Curie International Incoming Fellowship, 2011）。2014年4月回国在中国科学院大连化学物理研究所催化基础国家重点实验室工作，任副研究员。2015年8月加入南京大学生命分析国家重点实验室，任副教授。已经发表SCI论文40余篇，申请国家发明专利2项。主持和参与国家自然科学基金项目多项。
课题组链接：https://www.jun-lab.cn/
Jielin Chen, Mingpan Cheng, Jiawei Wang, Dehui Qiu, David Monchaud, Jean-Louis Mergny, Huangxian Ju*, Jun Zhou*,
Chin. J. Catal.,
2021, 42: 1102–1107.
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