刘耀光组封面论文报道首例胚乳富含花青素的水稻新种质“紫晶米”丨BioArt特别推荐

BioArt按：多个基因的组装与转化（Transgene Stacking）一直都是植物合成生物学、代谢工程、多基因农艺性状改良等领域的技术难题和研究热点。花青素（Anthocyanin）是黄酮类植物色素，作为植物营养素具有强抗氧化活性，对人体的健康具有重要的保健作用，但在粮食作物的胚乳中并不存在。因此，通过基因工程方式进行营养强化（Biofortification） 在水稻胚乳合成花青素，是功能型水稻育种的目标之一。但由于花青素生物合成涉及多个基因，代谢调控十分复杂，以及多基因操作的技术瓶颈，未能获得成功。6月27日，华南农业大学生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光研究员课题组在Molecular Plant 杂志以封面文章形式发表了题为“Development of “Purple Endosperm Rice” by Engineering Anthocyanin Biosynthesis in the Endosperm with a High-Efficiency Transgene Stacking System”的研究论文。该研究利用Cre/loxP重组系统和新创建的不可逆重组的突变loxP位点，开发了新一代的高效多基因载体系统TGS II（TransGene Stacking II）。通过使用该系统，成功把花青素合成相关的8个关键基因转入水稻，实现了花青素在水稻胚乳特异合成，创造出首例富含花青素的水稻新种质“紫晶米”。此研究成果表明，TGS II载体系统作为一种高效的技术平台，具有广泛的应用前景。论文第一作者为祝钦泷副研究员，论文通讯作者为刘耀光研究员。该研究得到国家自然科学基金、农业部转基因专项和广东省公益与能力建设项目的资助。 

论文解读：

合成生物学、复杂代谢途径的基因工程操作以及涉及多个基因的重要农艺性状的改良，都需要用到多基因组装与转化载体系统（或称为转基因堆积系统），在生物体内同时堆积和表达多个基因。而现有的一些多基因载体系统仍然存在着操作困难，费时、耗力的问题。因此，开发一种操作简单和高效的多基因组装与转化载体系统具有重要的理论与实践意义。

刘耀光研究员课题组曾经开发了大片段转化系统（Liu et al., 1999; Liu et al., 2002）和第一代多基因载体系统（TransGene Stacking I, TGS I）(Lin et al., 2003）。在此基础上，他们又开发了新一代更加高效与自动化的多基因载体系统TGS II。TGS II系统由基于可转化人工染色体（TAC）的接受载体系统（Acceptor vectors）、两类供给载体（Donor vectors）和可选择使用的筛选标记删除Marker-free供给质粒组成。在Cre重组酶的作用下，利用loxP位点先把含有一个或多个目的基因的供给载体质粒整合到双元接受载体上，再利用一组可进行不可逆重组的突变loxP位点（loxP1L/ loxP 1R或loxP2L/ loxP 2R）自动删除供给载体的骨架，只留下目的基因在双元接受载体上（下图1）。通过两类供给载体轮流对接受载体进行有序的多轮重组，完成多基因组装。最后，再用Gateway BP反应，把Marker-free供给质粒上的标记基因和标记删除基因整合到多基因载体上，最终获得具有Marker-free功能的多基因载体。为了证明TGS II载体系统的有效性，刘耀光研究员课题组以花青素的水稻胚乳特异合成为目标，开展了进一步的研究。

图1：多基因载体组装示意图

花青素（Anthocyanins）是许多观赏植物和水果的主要色素，同时也是一类重要的植物营养素，具有很强的抗氧化活性，对人体的健康具有重要的保健作用。花青素的生物合成途径是目前研究得最广泛和最复杂的代谢途径之一，涉及到结构基因、修饰基因、转运蛋白和调节基因等10多个基因构成。调节基因包括R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40转录因子，通过形成一个称为MBW的复合体，调控整个代谢通路基因的组织特异性表达。只有当上述合成途径的所有基因同时功能表达时，才能形成花青素。

天然的有色类谷物的花青素等色素只存在于种皮中，作为主要食用部分的胚乳并不含花青素。如传统食用的黑米都是糙米，其口感和蒸煮特性都较差。而进行精加工去掉种皮（麸糠）变成精米后，又失去了种皮含有的花青素等营养成分。因此，如能在胚乳中进行功能性的营养强化产生花青素，则可以解决上述问题，增加稻米（精米）的营养品质和经济价值。为了上述目标，国际上多个研究组进行了各种尝试，如Shin等（2006）在胚乳特异表达了2个调节基因、和Ogo等（2013）在胚乳特异表达了几个结构基因，都只合成了类黄酮的中间产物，未能成功产生花青素。

为了解决在水稻胚乳产生花青素的育种难题，刘耀光课题组通过对白米品种的花青素合成相关基因的序列分析和表达分析，发现白米品种水稻中存在调节基因（如bHLH类型的OsB2和MYB类型的OsC1）和结构基因（如DFR）的功能缺失，其它相关基因在胚乳中也是不表达或低表达的。在此基础上，提出了导入转录因子组合加整套结构基因组合的新策略。采用TGS II载体系统和新策略，他们构建了一个具有10个基因（T-DNA区大约31 kb）的多基因载体（下图2），包括用于胚乳特异合成花青素的8个基因（2个来源于玉米的调节基因和6个来源于彩叶草的整套结构基因，全部基因以不同的胚乳特异启动子控制）和2个用于marker-free的基因（标记基因HPT和花药特异启动子控制的Cre基因，在转基因植物的花粉中能实现筛选标记的自动删除）。通过农杆菌介导的水稻遗传转化，在粳稻（ZH11）和籼稻 (HG1)中实现了花青素在胚乳的特异合成，首次创造出具有高抗氧化活性的紫色胚乳水稻“紫晶米”（下图3）。

图2：用于胚乳特异合成花青素的多基因载体结构图谱

图3：水稻胚乳的花青素合成

上述研究成果表明， 利用高效的TGSII载体系统，能够高效实现复杂代谢途径的多基因操作。“紫晶米”种质的成功培育，为谷物营养强化和功能性谷物育种提供了新的思路。TGSII载体系统能为需要多基因操作的合成生物学、复杂代谢途径的基因工程、和复杂农艺性状的遗传改良等提供有效的技术平台。

此外，TGSII载体系统也是一个多功能的技术平台，只需把接受载体上的核心功能元件克隆到其它类型的载体上，就能在适合各种生物的载体系统中方便地进行多基因的组装。

刘耀光课题组研究团队

参考文献： 

Lin, L., Liu, Y.G., Xu, X., Li, B., 2003. Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assembly and transformation vector system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5962-5967.

Liu, Y.G., Liu, H., Chen, L., Qiu, W., Zhang, Q., Wu, H., Yang, C., Su, J., Wang, Z., Tian, D., Mei, M., 2002. Development of new transformation-competent artificial chromosome vectors and rice genomic libraries for efficient gene cloning. Gene 282, 247-255.

Liu, Y.G., Shirano, Y., Fukaki, H., Yanai, Y., Tasaka, M., Tabata, S., Shibata, D., 1999. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6535-6340.

Ogo, Y., Ozawa, K., Ishimaru, T., Murayama, T., Takaiwa, F., 2013. Transgenic rice seed synthesizing diverse flavonoids at high levels: a new platform for flavonoid production with associated health benefits. Plant Biotechnol. J. 11,734-746.

Shin, Y.M., Park, H.J., Yim, S.D., Baek, N.I., Lee, C.H., An, G., Woo, Y.M. 2006. Transgenic rice lines expressing maize C1 and R-S regulatory genes produce various flavonoids in the endosperm. Plant Biotechnol. J. 4, 303-315.

BioArt，一心关注生命科学，只为分享更多有种、有趣、有料的信息。关注请长按上方二维码。投稿、合作、转载授权事宜请联系微信ID：fullbellies或邮箱：[email protected]。