文章来源于分子庄园，作者木子庄主
蛋白酶K（E. C. 3. 4. 21. 64）是真菌（林伯氏白色念球菌、Tritirachium album Limber）合成的胞外内肽酶，它是具有典型催化三元组Asp39-His69-Ser224的丝氨酸蛋白酶类中的一员。由于它能降解角蛋白（keratin），因此被命名为蛋白酶K。
胞外酶是指那些在细胞内合成后穿过细胞质膜的酶。它们有些镶嵌在质膜上，有些存在于周质空间，有些则完全脱离其生产者扩散到环境中。
胞内酶是在细胞内起催化作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在内质网的核糖体上。
肽酶是一种能够水解肽链的酶，肽酶可以分为两大类型，即内肽酶(E.C.3.4.21~3.4.99)和外肽酶(E.C.3.4.11~3.4.19)。
其中内肽酶作用于多肽链内部的特定肽键，如存在于动物消化道的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等，这些酶对不同氨基酸组成的肽键有特异性；外肽酶作用于蛋白质肽链两端肽键的酶，作用于氨基端肽键的称氨基肽酶，作用于羧基端肽键的称为羧基肽酶。
蛋白酶K由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，
相对分子质量为28930（
28.9 KDa）。活性部位由D39、H69和S224组成，底物识别位点主要为G100-Y104和S132-G136两个片段。
蛋白酶K的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌蛋白酶具有高度同源性，因此被划分为枯草芽孢杆菌蛋白酶类。蛋白酶K包含两个二硫键（C34-C124，C179-C248），两个色氨酸残基（W8，W212）和一个游离半胱氨酸（C73）。
X射线晶体学研究表明，蛋白酶K的三维结构为一个明确的球形折叠。蛋白酶K属于α/β类蛋白质，包含6个α-螺旋，15个β-折叠和一个3/10螺旋。
α-螺旋是保持蛋白酶K活性中心构象稳定性的主要结构。α-螺旋共包含90个氨基酸残基，占残基总数的1/3，大部分残基处在伸展的β-折叠结构中。这使得整个分子有序度低，变性熵不大，比变性焓值极低，反映了酶稳定性的本质。
蛋白酶K具有很高的切割活性，底物识别位点能和底物组成一个3股的反平行β片层，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。蛋白酶K偏好的切位是在疏水性氨基酸后的位置。
蛋白酶K对于钙离子具有两个结合位点，都在活性中心附近，但都与催化反应无直接关联。
虽然钙并不会影响蛋白酶K的活性，但它可使蛋白酶K更稳定。蛋白酶K由Ca2+活化，若移除钙离子，蛋白酶K的稳定性会大幅降低，但其水解活性仍然存在，
因而其活性的大发挥需要一定浓度的Ca2+。
蛋白酶K分子中两个二硫键及两个Ca2+都对三级结构的热稳定性有贡献。两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液剂和去污剂具有高得多的稳定性。
蛋白酶K在295nm处被激发，它的荧光性由两个色氨酸残基W8和W212决定。
但是，两个色氨酸的光反应活性表现不同，W212要活泼得多。在pH3～9范围内，色氨酸荧光量子产率恒定。对已激发的色氨酸进行热力灭活时，活化能需达到54 kJ/mol。这个值大幅地高于来自微生物的其他蛋白酶，因此可用来解释蛋白酶K较高的热稳定性。
蛋白酶K具有广泛的底物特异性，偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端连接的肽键。
即便存在洗涤剂的情况下，其仍可降解许多非变性状态的蛋白质。
在足量蛋白酶K浓度及作用时间的环境下，蛋白质会完全被水解，蛋白酶K能非特异性水解天然的和变性的蛋白质。
蛋白酶K具有其他蛋白酶所不具备的高活力和高稳定性，其酶活性不会被尿素、SDS和EDTA等变性剂抑制，并且在高温（50~70℃)、高盐以及广泛的pH范围（4~12.5）等条件下，蛋白酶K仍能保持较高活性。
蛋白酶K常常被用于样本前处理试剂中，虽然说蛋白酶K的稳定性很高，但在实际应用中，总会发现蛋白酶K不能带来很好的功效，那么蛋白酶K在不同条件下的稳定性和功能性是怎么样的？
无论是甲醇、乙醇、异丙醇等常用的醇溶液中，不同比例下都会影响到蛋白酶K的蛋白水解活性。其中，上述三种常见醇中，异丙醇的影响最大。
b.
蛋白酶K在不同浓度GuHCl的稳定性（pH=7）
蛋白酶K在GuHCl(盐酸胍)的浓度在4M以上，蛋白酶K的功能结构开始发生改变，并且随着GuHCl浓度的提升，功能结构变化越来越大。
蛋白酶K的最佳反应温度为60ºC，但在60ºC或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多时候反应温度选择50-55ºC
蛋白酶K在60℃以上，蛋白酶K的功能结构开始发生改变，并且随着温度的升高，功能结构变化越来越大。
综上，蛋白酶K在各类样本前处理试剂中，尤其是核酸提取中，醇的比例是影响最大的部分，对于裂解-结合一步法的基因组核酸提取试剂，异丙醇常常为40%左右，使得蛋白酶K的活性下降，另外，在4M的胍盐和65℃的裂解温度下，蛋白酶K常常很短的时间内就失去了活性，无法进一步的水解样本中的蛋白，释放核酸，最终导致核酸提取试剂的性能不理想。
蛋白酶K酶活力，>30U/mg。在37ºC，以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1微摩尔酪氨酸Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。
蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用，苯甲基磺酰氟是一种丝氨酸蛋白酶的抑制剂。
蛋白酶K是一种高活性的广谱蛋白酶，其活性不受SDS、尿素、EDTA、盐酸胍、异硫氰酸胍等的抑制，在裂解液溶液中依然能保持较高酶活力，且一定含量的去垢剂还可以增强蛋白酶K的活性，所以被广泛应用于各类生物样本中的DNA或RNA的提取。
蛋白酶K在0.2-1%SDS或约10mM尿素存在的情况下，蛋白酶K显示更高的酶活性。
蛋白酶K在很宽的pH范围内有效，有效的pH范围为pH4.0-12.5，最佳pH范围为pH7.5-8.0。
蛋白酶K的常用工作浓度一般为0.05-2mg/ml，应根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。
b.在分离DNA和RNA的过程中，用于核酸酶的蛋白水解失活
蛋白酶K还常被用于RNA提取过程中抑制和降解RNase，防止提取的RNA被降解。
蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前标本的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以利于检测探针的穿透，增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号和检测的敏感性。
病毒外层结构一般以衣壳蛋白为主，因此蛋白酶K可以对病毒表面的蛋白进行破坏，进而造成病毒因结构不完整不再具有攻击宿主细胞的能力。
