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星形胶质细胞LRP1介导线粒体转移并通过抑制神经元ARF1乳酸化减轻脑缺血

BCML速递 · 公众号 · · 2024-09-20 22:00

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急性缺血性脑卒中是全球主要的致残和致死疾病之一。缺血性卒中时脑血流（ CBF ）的紊乱限制了氧气和能量底物的输送，导致线粒体功能障碍和细胞生物能量应激，造成不可逆的神经损伤。线粒体作为细胞内的能量工厂，对维持细胞正常功能必不可少。在中枢神经系统中，由星形胶质细胞向神经元进行健康线粒体的转移对于维持神经功能和损伤的修复至关重要。低密度脂蛋白相关受体蛋白 1 （ LRP1 ）是一种重要的细胞表面受体，已被证实在多种组织中调节多种细胞功能，并与神经退行性疾病的发病机制密切相关。然而， LRP1 在缺血性卒中病程中的具体作用尚未完全阐明。近期，来自西南医科大学江涌教授、四川大学李涛教授和中国科学技术大学曹洋教授合作，探究了 LRP1 在星形胶质细胞 - 神经元通讯中的功能。

据报道，星形胶质细胞可以释放健康的线粒体并将其转移到邻近的神经元以恢复神经元健康。研究者将带有标记线粒体的星形胶质细胞与神经元共培养 , 观察到含线粒体的细胞外囊泡和游离线粒体向邻近神经元的转移，从而进一步验证了这一观点。利用短发夹 RNA （ shLrp1 ）敲除小鼠星形胶质细胞中的 Lrp1 基因，并在孵育 24 小时后收集培养基（图 1A-B ），结果表明与对照组相比， Lrp1 敲除减少了培养基中游离线粒体的数量，伴随着耗氧量和 ATP 产量的减少（图 1D-E ）。接下来，研究者从 mitoSypHer 标记的星形胶质细胞中分离细胞外游离的线粒体，并将其添加到小鼠 HT22 海马神经元中。荧光结果证实与对照组相比， Lrp1 缺失的细胞培养基处理的神经元中较少出现标记的线粒体（图 1F ）。此外，在神经元 - 星形胶质细胞共培养 24 小时后，在对照神经元中观察到更多的线粒体，而在 Lrp1 缺失组中没有（图 1G) ，并同步降低了共培养神经元的耗氧量和 ATP 产生（图 1H ），表明 Lrp1 的敲除减少了线粒体由星形胶质细胞向神经元的转移。

研究者接下来探究了 LRP1 介导的线粒体转移是否对神经元的急性死亡有影响。为此，在氧气和葡萄糖剥夺（ OGD ）条件下，将 HT22 神经元和对照或 Lrp1 敲除的星形胶质细胞共培养 2 小时，然后复氧 18 小时（图 1I ）。星形胶质细胞的活力和线粒体功能均未出现明显损伤，同时与对照组星形胶质细胞共培养的神经元在 OGD/ 复氧处理后保留了活力，而与 Lrp1 敲除星形胶质细胞共培养神经元的活力明显降低（图 1I ）。当用从对照或 Lrp1 缺失的星形胶质细胞分离的细胞外游离线粒体处理 OGD/ 复氧神经元时，观察到类似的效果（图 1J ）。综上所述，这些结果表明星形胶质细胞中 Lrp1 基因的缺失减少了星形胶质细胞到神经元的线粒体转移，并使神经元对急性应激更加敏感。

LRP1 是低密度脂蛋白受体家族的重要功能组成部分，参与调控中枢神经系统的代谢稳态。进一步，研究人员利用靶向代谢技术探究 LRP1 对星形胶质细胞代谢的影响。结果表明，在 Lrp1 缺失的星形胶质细胞中观察到细胞内葡萄糖和糖酵解中间体 3- 磷酸甘油醛以及乳酸的增加，同时许多三羧酸循环的中间体，包括琥珀酸、草酰乙酸和苹果酸也显著上调（图 2A ）。除了积累的糖酵解和三羧酸循环代谢物外，耗氧量（ OCR ）和细胞外酸化率（ ECAR ）在 Lrp1 缺失的星形胶质细胞中均增加（图 2B-C ）， ECAR/OCR 比率和 ATP 产生率也显著增加，表明相对于氧化磷酸化，糖酵解过程显著增强（图 2D ）。进一步 ¹³ C 同位素标记等实验验证发现 Lrp1 的缺失，通过促进 GLUT1 显著增加了星形胶质细胞内的葡萄糖摄取（图 2E ）。与此同时，相较于对照组，接受 shLrp1 的星形胶质细胞和培养基中乳酸含量增加，伴随着乳酸脱氢酶（ LDH ）活性，以及 LDHA/B 、磷酸果糖激酶（ PFK ）和丙酮酸激酶（ PK ）的蛋白水平升高，表明 Lrp1 缺失时细胞有氧糖酵解的激活（图 2F-I ）。除了糖酵解，乳酸也可以通过谷氨酰胺和乙酸盐的氧化产生。因此，研究者分别用 [U- ¹³ C] 葡萄糖、 [U- ¹³ C]L- 谷氨酰胺或 [U- ¹³ C] 乙酸盐标记星形胶质细胞。（图 2J ）。结果表明，在星形胶质细胞中谷氨酰胺或乙酸盐仅在很小程度上转化为乳酸，大多数乳酸由葡萄糖产生（图 2K-L ）。这些结果表明星形胶质细胞中 Lrp1 缺失通过激活糖酵解从而产生大量乳酸。

接下来，研究试图确定乳酸积累是否会影响星形胶质细胞线粒体的释放。缺氧处理星形胶质细胞以诱导无氧糖酵解（图 3A ），结果显示缺氧导致细胞内的乳酸增加，细胞外游离线粒体和 ATP 水平降低，提示缺氧抑制线粒体的释放（图 3B ）。相比之下，利用一种糖酵解的抑制物—— 2- 脱氧 -d- 葡萄糖（ 2-DG ）抑制乳酸的产生，导致细胞外游离线粒体和 ATP 产生的激增（图 3C ）。同时，一种 LDHA/B 的选择性抑制剂——（ R ） -GNE-140 处理或 Ldha/b 敲除的星形胶质细胞减少了乳酸的产生，并增加了细胞外游离线粒体以及 ATP 水平，这些影响被外源性的乳酸盐的补充所逆转（图 3D-E ）。同时， Ldha/b 的缺失完全阻断了 Lrp1 shRNA 对线粒体释放的抑制作用，而 Ldha/b 的过表达表现出与 Lrp1 shRNA 相似的作用（图 3F-G ）。为了测试乳酸是否调节星形胶质细胞的线粒体释放，研究者用梯度剂量的乳酸孵育细胞 2 小时。乳酸处理以剂量依赖的方式降低细胞外游离线粒体和 ATP 的水平（图 3H ），表明乳酸能够抑制星形胶质细胞线粒体的释放。综上所述，这些发现表明 LRP1 通过介导星形胶质细胞中的乳酸增加从而抑制线粒体释放。

随着乳酸水平的升高，研究者观察到在 Lrp1 敲除的星形胶质细胞中整体蛋白赖氨酸乳酸化（ Kla ）水平的升高（图 4A ）。乳酸化修饰组学技术对对照组和 Lrp1 敲低的星形胶质细胞进行了分析，发现 136 种 Kla 修饰改变的蛋白质，其中 84 种位于细胞核中， 32 种在细胞质中（图 4B ）。值得注意的是， ARF1 第 73 处赖氨酸（ ARF1-Kla ⁷³ ）的乳酸化是细胞质中最高的乳酸化赖氨酸残基之一（图 4C-E ）。此外，从基因本体注释的分子功能和细胞成分方面来看， ARF1 与 LRP1 具有最高的功能相似性（图 4F ）。此外，研究者对这些高乳酸化胞质蛋白进行了蛋白质 - 蛋白质相互作用网络分析，发现 ARF1 及其相关蛋白在囊泡出芽、转运和定位过程中高度富集（图 4G ），表明其介导线粒体释放的潜在功能。此外，免疫沉淀 / 蛋白质印迹分析显示，接受 shLrp1 的星形胶质细胞中的高乳酸化与 ARF1 的激活（更多的 GTP 与 ARF1 结合）相偶联，这是调节囊泡运输所必需的（图 4H ）。为了验证 ARF1-Kla ⁷³ 是否是线粒体释放的关键介质，研究者将 ARF1 的 73 位赖氨酸突变为精氨酸（ K73R ），这阻止了乳酸化修饰（图 4I ），观察到 ARF1 活性抑制和线粒体释放的上调（图 4I-K ）。相比之下，模拟乳酸化的 K73 突变为谷氨酰胺（ K73Q ）导致 ARF1 的激活和线粒体释放的抑制（图 4I-K ）。这些发现表明乳酸通过介导 ARF1-Kla ⁷³ 减少星形胶质细胞的线粒体释放。

接下来作者在动物体内进行了验证。通过眶后静脉窦注射靶向星形胶质细胞的腺病毒（ AAV ）干预 LPR1 的表达（图 5A ）。与在细胞模型中观察到的结果一致， Lrp1 条件性敲除小鼠表现出大脑中葡萄糖摄取增加和乳酸水平升高，引起脑脊液星形胶质细胞来源的线粒体数量下降（图 5B-D ）。为了进一步研究星形胶质细胞线粒体，研究者使用 AAV2-GfaABC1D-Cre 驱动的 PhAMfloxed （光激活线粒体）来标记 Lrp1 条件敲除小鼠的星形胶质细胞线粒体。通过共聚焦显微镜和活体双光子成像显示，在神经元中也观察到星形胶质细胞来源的的线粒体减少（图 5E ）。随后，研究者通过大脑中动脉栓塞（ MCAO ）建立脑缺血模型，结果发现 Lrp1 敲低的小鼠在 MCAO 手术后表现出更大的脑梗死区域（图 5F ），且表现出更差的神经功能（图 5G ）。此外，在梗死区域边缘的神经元内，特别是来自星形胶质细胞的线粒体数量减少，并且这些神经元的线粒体功能受损（图 5H-J ）。证实了 LRP1-ARF1 Kla73 轴在调控星形胶质细胞线粒体转运中的重要作用。

研究者进一步将携带 ARF1 野生型 (WT) 、 ARF1 K73R 或 ARF1 K73Q 的 AAV2 注射到特异性敲除 Lrp1 的小鼠中。与对照组相比，接受 ARF1 K73R 的小鼠在中枢神经和神经元中表现出更多的星形胶质细胞衍生的线粒体，而接受 ARF1 K73Q 的小鼠表现出星形胶质细胞衍生的线粒体减少（图 6A-B ），表明在不存在 Lrp1 的情况下，减少 ARF1 乳酸化会增加星形胶质细胞线粒体的释放。然后，研究者使用 MCAO 在这些小鼠中诱导缺血再灌注损伤，以评估 ARF1 K73R 和 ARF1 K73Q 在脑损伤中的作用。与用 ARF1 WT 治疗的 Lrp1 cKD 小鼠相比，接受 ARF1 K73R 的小鼠表现出梗死面积的减少、神经功能的改善，以及边界区神经元中星形胶质细胞衍生线粒体的增加。相反，接受 ARF1 K73Q 的 Lrp1 cKD 小鼠表现出更大的梗死面积、恶化的神经功能和神经元中星形胶质细胞衍生线粒体的减少（图 6C-F ）。这些结果表明星形胶质细胞 ARF1 乳酸化减少线粒体转移，加重脑缺血再灌注损伤（图 6C-F ）。为了验证该发现的临床相关性，研究者定量了人类中风患者和正常参与者的脑脊液乳酸含量。与正常对照组相比，缺血组脑脊液乳酸显著升高（图 6G ），乳酸水平显示出与梗死面积正相关的趋势，与脑脊液中星形胶质细胞来源线粒体负相关的趋势（图 6H-I ）。这些结果支持乳酸抑制线粒体转移并加重脑缺血再灌注损伤的结论。

综上所述，研究揭示了 LRP1 在线粒体转移中的新功能： LRP1 通过调节星形胶质细胞的乳酸代谢和 ARF1 的乳酸化修饰，进而影响线粒体的外排和转移。 ARF1 K ⁷³ 的乳酸化修饰则可能通过限制线粒体的转移来加剧脑损伤，减少 ARF1 K73 的乳酸化修饰可能通过促进线粒体的转移来保护神经元。研究为理解线粒体稳态和乳酸化修饰在脑缺血中风中的作用机制提供了新的视角，为开发脑缺血中风的治疗策略提供新的思路。

本研究由西南医科大学江涌教授、四川大学李涛教授和中国科学技术大学曹洋教授合作完成，于 06 月 20 日在线发表于 Cell Metabolism 。

论文信息：Jian Zhou, Lifang Zhang, Jianhua Peng, Xianhui Zhang, Fan Zhang, Yuanyuan Wu, An Huang,Fengling Du, Yuyan Liao, Yijing He, Yuke Xie, Long Gu, Chenghao Kuang, Wei Ou, Maodi Xie, Tianqi Tu, Jinwei Pang, Dingkun Zhang, Kecheng Guo, Yue Feng, Shigang Yin, Yang Cao,* Tao Li,* and Yong Jiang*, Astrocytic LRP1 enables mitochondria transfer to neurons and mitigates brain ischemic stroke by suppressing ARF1 lactylation, Cell Metab 2024, 36: 2054-2068.

供稿：朱壮

审校：朱彩虹

编辑：刘怿斯