摘
要：目的
研究甘草汁蒸制前后高乌头
Aconitum sinomontanum
石油醚部位
HPLC
指纹图谱与行气药效之间的相关性，为明确甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位理气药效物质基础提供实验依据。
方法
通过
HPLC
法建立
10
批不同产地生、制高乌头石油醚部位（
S1
～
S10
、
Z1
～
Z10
）指纹图谱；采用炭末推进法评价甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位的行气作用；同时采用灰色关联度分析方法，对
7
批生、制高乌头石油醚部位进行谱效相关性分析，找到各自药效贡献较大成分，评价二者相似性。
结果
不同产地生、制高乌头石油醚部位有促进小鼠小肠运动的作用，其中以
Z2
、
S3
作用能力最强。甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位发挥行气作用的药效是多种成分共同作用的结果，其中生品高乌头石油醚部位各共有峰所代表的化学成分对其行气作用贡献的大小顺序为（关联度＞
0.8
）
40
号峰＞
7
号峰＞
30
号峰＞
14
号峰＞
36
号峰＞
24
号峰＞
13
号峰＞
15
号峰＞
33
号峰＞
23
号峰＞
41
号峰＞
43
号峰＞
9
号峰＞
21
号峰＞
28
号峰＞
31
号峰＞
37
号峰＞
17
号峰＞
34
号峰；制品高乌头石油醚部位各共有峰所代表的化学成分对其行气作用贡献的大小顺序为（关联度＞
0.8
）
41
号峰＞
29
号峰＞
4
号峰＞
27
号峰＞
30
号峰＞
33
号峰＞
34
号峰＞
20
号峰＞
1
号峰＞
45
号峰＞
22
号峰＞
19
号峰＞
38
号峰＞
31
号峰＞
18
号峰＞
14
号峰＞
28
号峰。
结论
通过谱效关系研究获得了甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位的行气药效物质群，其行气药效是多种成分共同作用的结果，为探索甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位行气作用物质基础的研究提供了参考。
高乌头为毛莨科乌头属植物高乌头
Aconitum sinomontanum
Nakai
的根，又称麻布七、麻布袋、统天袋、穿心莲（四川）、麻布口袋等
[1]
，在《中华本草》《中药大辞典》等本草著作中均有记载，现收载于
2009
年版《甘肃省中药材标准》。高乌头为我国中西部地区民间习用中药，是著名的“七药”之一
[2]
，高乌头疗效良好，却因其毒性而临床使用受限。其辛、苦、温，有毒，具祛风除湿、理气止痛、活血散瘀之功，临床上常用于治疗类风湿性关节炎和局部镇痛，还可用于治疗胃痛、脘腹胀满、急慢性菌痢、急慢性肠炎等。
高乌头含有生物碱、黄酮、甾体、糖苷类等化学成分
[3-5]
，现代药理研究表明，其具有镇痛、抗炎、局麻、解热、抗肿瘤等广泛作用
[6-7]
。目前，对高乌头报道最多的是其化学成分研究，包括单体化合物提取、分离、衍生化等，其次是资源开发，包括人工驯化及组织培养等，而有关毒性药效的研究多以高乌甲素单体为主，有效部位的研究较少
[8]
。目前，其理气作用的研究尚未见报道。
辛可行气，与胃肠运动有一定联系，为进一步全面研究高乌头石油醚部位药效作用，更加科学地诠释该部位药效，本实验从甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位的
HPLC
指纹图谱与行气药效的关系入手，采用灰色关联分析
[9]
对谱效关系进行研究，从而明确其行气药效物质基础，为高乌头的开发与应用提供实验依据和理论支持。
1
材料
10
批不同产地或采收期高乌头药材，经甘肃中医药大学附属医院杨锡仓主任中药师鉴定，为毛茛科乌头属植物高乌头
A. sinomontanum
Nakai
的干燥根，具体编号及来源见表
1
。
LDZX-30FA
立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；
BT125D
型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；
KQ3200DB
型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；
FW-400A
型高建万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；
HHS-11S
型数显恒温水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；
1100 Series
型高效液相色谱仪，美国
Agilent
科技有限公司，含
DAD
检测器；
SHB-3
型循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；
Buchi R-200
旋转蒸发仪，瑞士
Buchi
实验室仪器公司。
高乌甲素对照品，甘肃神龙药业股份有限公司，批号
20001001
，质量分数≥
98%
；冉乌头碱对照品，成都克洛玛生物科技有限公司，批号
150404
，质量分数≥
98%
；乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸二氢钠，色谱纯，天津大茂化学试剂厂；石油醚、乙醇，分析纯，天津大茂化学试剂厂；西沙比利胶囊，山东淄博新达制药有限公司，批号
180706
，规格
5 mg
。
昆明种小鼠，
SPF
级，体质量（
20
±
2
）
g
，雌雄各半，由中国农业科学研究院兰州兽医研究所实验动物中心提供，实验动物生产许可证号
SCXK
（甘）
2015-0001
。饲养条件：甘肃中医药大学中药药理实验室，环境温度（
23
±
2
）℃，相对湿度
50%
～
60%
。动物实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准文号
SYXK
（甘）
2015-0002
。
2
方法与结果
2.1
生
、
制高乌头饮片的制备
高乌头药材净制润软后，切制约为
5 mm
的片段，自然干燥，即得高乌头生品饮片。生品饮片用
10%
的甘草汁（
3 mL
含
1 g
甘草）润透后，置立式压力蒸汽灭菌器内，温度
127
℃，压力
0.5 MPa
条件下蒸制
5 h
，取出晾干，即得高乌头炮制品饮片
[10]
。
2.2
生
、
制高乌头石油醚部位的制备
分别取生、制高乌头饮片，加入
10
倍量
95%
乙醇冷浸
24 h
后超声提取，超声（功率
300W
、频率
40 kHz
）
45 min
，冷浸超声提取
2
次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，即得高乌头醇提物。所得稠膏继续加水制成混悬液，用石油醚萃取
4
次，每次
200 mL
，
35
℃以下减压回收石油醚，即得生、制高乌头石油醚部位
[11-12]
。
2.3
溶液的制备
2.3.1
供试品溶液制备
分别取“
2.2
”项生、制高乌头石油醚部位浸膏
0.5 g
，精密称定，加甲醇溶解，定容至
10 mL
，密塞，摇匀，进样前用
0.45 μm
微孔膜滤过，即得。
2.3.2
对照品溶液制备
分别精密称定高乌甲素、冉乌头碱对照品
8.01
、
2.96 mg
，置于
10 mL
量瓶中，加甲醇至刻度线，即得高乌甲素与冉乌头碱混合对照品溶液（含高乌甲素
0.801mg/mL
、冉乌头碱
0.296 mg/mL
）。
2.4
色谱条件
采用
Dikmaspursil C
18
色谱柱（
250 mm
×
4.6 mm
，
5 μm
），流动相为
0.05 mol/L
磷酸二氢钠水溶液
-
乙腈，梯度洗脱，洗脱条件见表
2
，进样量
10 μL
，柱温
35
℃，检测波长
235
、
254
、
280
、
290
、
308 nm
[13-14]
。
2.5 HPLC-DAD
指纹图谱的建立
2.5.1
精密度试验
取适量高乌头石油醚部位浸膏（
S1
），按“
2.3.1
”项下方法制备供试品溶液，按“
2.4
”项下色谱条件进样分析，连续进样
6
次，将所得色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（
2012
版）”，得到各图谱的相似度均大于
0.96
，计算
45
个主要共有峰相对保留时间
RSD
＜
2%
，峰面积
RSD
＜
2%
，表明此方法精密度较好。
2.5.2
稳定性试验
取适量高乌头石油醚部位浸膏（
S1
），按“
2.3.1
”项下方法制备供试品溶液，分别在
0
、
2
、
4
、
8
、
12
、
24 h
，按“
2.4
”项下色谱条件进行测定，将所得色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（
2012
版）”，得到各图谱的相似度均大于
0.94
，计算
45
个主要共有峰相对保留时间
RSD
＜
2%
，峰面积
RSD
＜
2%
，表明供试品溶液在
24 h
内稳定。
2.5.3
重复性试验
取适量高乌头石油醚部位浸膏（
S1
），按“
2.3.1
”项下方法平行制得
6
份供试品溶液，按“
2.4
”项下色谱条件进行测定，将所得色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（
2012
版）”，得到各图谱的相似度均大于
0.90
，计算
45
个主要共有峰相对保留时间
RSD
＜
2%
，峰面积
RSD
＜
2%
，表明该方法重复性较好。
2.5.4
生、制高乌头石油醚部位
HPLC-DAD
指纹图谱建立
取“
2.2
”项下制备的
10
个不同批次高乌头石油醚部位，按“
2.3.1
”项下方法制备供试品溶液，按“
2.4
”项下色谱条件进样分析，每个样品选取
235
、
254
、
280
、
290
、
380 nm 5
个色谱峰信息相对丰富的波长作为匹配基准，将不同波长检测到的同一成分进行匹配，若该成分不出峰则峰积分计
0
[15-16]
，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（
2012
版）”，以
S1
、
Z1
样品为参照图谱，采用中位数矢量法进行多点校正生成生、制高乌头石油醚部位多波长融合
HPLC-DAD
指纹图谱（
MWFF
），并生成对照指纹图谱（
R
），再对其进行相似度评价。在
0
～
110 min
内，以稳定性和重复性好、特征明显的色谱峰作为共有峰。
5
个不同波长下
10
批生、制高乌头石油醚部位的
HPLC
图谱、
MWFF
指纹图谱共有模式及对照指纹图谱分别见图
1
～
3
，生、制高乌头石油醚部位的共有峰峰面积见表
3
、
4
。每批生、制高乌头石油醚部位样品非共有峰总面积占总峰面积的比值均＜
10%
，符合指纹图谱要求。
2.6
高乌头石油醚部位行气作用的影响
取昆明种小鼠
224
只，雌雄各半，按随机数字表随机各分为
16
组，每组
14
只，雌雄各
7
只，即对照组（
0.5%
甲基纤维素）、阳性组（西沙比利
0.1 mg/kg
），
S1
～
S7
、
Z1
～
Z7
组，分别称取
S1
～
S7
、
Z1
～
Z7
组的高乌头石油醚部位于量瓶中，加入
0.5%
甲基纤维素制成混悬液进行使用，配制成
3.04 mg/mL
的生品高乌头石油醚部位混悬液及
4.39 mg/mL
的制品高乌头石油醚部位混悬液，各组小鼠按
20 mL/kg
进行
ig
给药，
1
次
/d
，连续给药
7 d
，于末次给药前禁食
12 h
，给药后
30 min
，每只小鼠
ig
给予新鲜配制的炭末混悬液（活性炭和阿拉伯树胶各含
10%
）
0.4 mL
，
20 min
后脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管。轻轻将小肠拉成直线，测量小肠全长与从幽门至炭末前沿的距离，计算小肠推进率，结果见表
5
。
小肠推进率＝炭末推进长度
/
小肠长度
2.7
生
、
制高乌头石油醚部位
HPLC
图谱与行气作用的灰色关联分析
2.7.1
原始数据的无量纲化处理
原始数据的变换采用均值化变换法。变换的母序列记为
{
Y
0
(
k
)}
，子序列记为
{
Y
i
(
k
)}
。将生、制高乌头石油醚部位行气作用的药效指标作为母序列，生、制高乌头石油醚部位的共有峰峰面积作为子序列。
2.7.2
绝对差序列及关联系数的计算
在
t
＝
k
时（
k
为不同产地批次编号），母序列记为
{
Y
0
(
k
)}
，子序列记为
{
Y
i
(
k
)}
，母序列与子序列的绝对差序列
δ
0
i
(
k
)
＝|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|（
1
≤
i
≤
m
）。计算在
t
＝
k
时母序列与子序列的关联系数
η
(
k
)
。
η
(
k
)
＝
(minmin
|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|＋
ρ
∙
maxmax
|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|
)/ (
|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|＋
ρ
∙
maxmax
|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|
)
Y
0
(
k
)
为生、制高乌头石油醚部位行气作用药效指标；
Y
i
(
k
)
为生、制高乌头石油醚部位各共有峰峰面积归一化数值；
k
为不同产地批次编号；
i
为峰号；
ρ
为分辨系数，在
0
～
1
取值，若
ρ
越小，关联系数间差异就越大，区分能力也越强，通常
ρ
取
0.5
；|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|为母序列与子序列的绝对差值；
minmin
|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|为绝对差值的最小值，又记为
δ
min
；
maxmax
|
Y
0
(
k
)
－
Y
i
(
k
)
|为绝对差值的最大值，又记为
δ
max
。
2.7.3
关联度（
r
）的计算
r
实质上是对时间序列几何关系的比较，是母序列与子序列各个时刻的关联系数的平均值，结果见表
6
、
7
。
m
为子序列的数据个数
由表
6
、
7
中
7
批不同产地生、制高乌头石油醚部位共有峰与其行气作用的关联分析数据可知，生品高乌头石油醚部位各成分对行气作用药效贡献度较大的共有峰（峰号）主要有峰
40
＞
7
＞
30
＞
14
＞
36
＞
24
＞
13
＞
15
＞
33
＞
23
＞
41
＞
43
＞
9
＞
21
＞
28
＞
31
＞
37
＞
17
＞
34
＞
1
＞
20
＞
35
＞
6
＞
45
＞
3
＞
44
＞
26
＞
29
＞
11
＞
10
＞
25
＞
18
＞
2
＞
8
＞
12
＞
5
，其中峰
40
、
7
、
30
、
14
、
36
、
24
、
13
、
15
、
33
、
23
、
41
、
43
、
9
、
21
、
28
、
31
、
