性能验证专题（六）：可报告范围

医学检验废品加工车间 · 公众号 · · 2024-04-27 11:00

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定量分析方法的可报告范围是临床实验室发出检验报告的依据之一，可报告范围的验证包括可报告低限（定量下限）与可报告高限（定量上限×样本最大稀释倍数）。现实中我们可能对此关注不多，但是在实际操作中该指标又是经常被使用和验证的。下文会对此进行相关的讨论。

可报告范围相关概念

测量区间（measuring interval）

在规定条件下，可由给定测量仪器或测量系统以规定的仪器不确定度测量的相同类量的量值的集合。

下图为可报告范围的构成：

LLOD:lower limit of detection（最低检出限）

LLOQ:lower limit of quantitation（定量下限）

ULOQ:upper limi t of quan tita tion（定量上限）

ULOE: u pper limi t of EMI（可报告范围上限）

AMI:analytical measuring interval（定量测量区间）

EMI:extended measuring interval（拓展测量区间）

稀释与基质效应

想要拓展测量区间，主要手段就是稀释。稀释的主要目的也就是获得高于定量限上限的样本结果。生产厂家在其说明中一般会注明已经经过验证的样本稀释剂。由于稀释会不可避免的改变患者标本的基质，待分析物中的蛋白质空间构型、酶活力或细胞的透过性都有可能影响试剂— 待测物之间的相互作用，一般来说理想的稀释剂应该是原始患者标本基质。对于化学测量程序（不牵扯抗原 - 抗体反应的），其基质效应比较小，可以使用生理盐水或去离子水作为稀释剂，但是对于其他测量程序（尤其是化学发光、使用抗原 - 抗体结合的反应），则一般会使用动物纯血清或缓冲蛋白基质物（如 BSA ）来减少基质效应的影响。

例如，进行 1:10 稀释时，我们会将 9 倍体积的稀释剂加入到待测样本中，那么最终的基质会由 100% 血清样本变到仅有 10% 的血清样本和 90% 的稀释剂。随着稀释比的增加，样本基质会变得越来越像稀释剂本身，此时的稀释操作下，分析结果的准确性就较少的取决于血清基质本身，而会更多的取决于准确稀释的能力以及测量过程对所得被测物的量值精度。

其实在实践中我们也会发现进行梯度稀释时，随着稀释倍数从 0 开始慢慢增加时，回收率偏倚就会逐渐增加，但是一旦超过某一个稀释度后，回收率则会慢慢变好，就像一个钟型曲线一样。这大概率就是基质变化所造成的。

所以千万不要随意使用稀释液，未经生产商声明的操作程序都需要进行确认实验，这在之前的篇章中已经说明。使用未经确认和验证的稀释液带来的偏倚是难以预估的（当然，临床要是非要来验证某种稀释液的回收率，其后果就是稀释后的异常结果难以解释）。

稀释度的选择

最大稀释度应该根据测量程序和医疗需要而确定，有些项目不需要或不能被稀释的应该要注意。比如生化项目的电解质项目或甲功项目中的 FT3 和 FT4 。电解质项目不能够被随意稀释是因为电解质排斥效应，随意稀释会造成结果的严重偏倚，尤其是使用直接离子选择电极法的。 FT3 和 FT4 之所以不能被稀释是因为血液中的 T3 或 T4 存在游离和蛋白结合状态的动态平衡，结合蛋白的浓度变化会打破这个平衡。

大家或许还见过这样的现象。一个浓度极其接近于线性范围上限的样本，有时直接测定会得到一个准确的结果，有时则会得到大于线性范围上限的结果（无具体浓度）。但是经过稀释后，发现其换算后的浓度竟然小于线性范围。比如某项目的线性范围是1~100，有一个样本直接上机测定，仪器结果显示>100，但是经过稀释并换算结果发现，其浓度只有92。根本就没有超过线性范围，但是为什么原倍测定会显示超过线性范围呢？

这是因为按照EP文件中的条款，生产商在确定线性范围上限时，应该考虑线性范围上限附近的样本会被稀释，而在稀释操作中会引入多种不确定因素，也就意味着稀释会比不稀释带来更大的不确定度。线性范围的上限应该考虑到这些不确定度。而有的生产商可能并没有完全考虑到该方面的影响或者手工稀释的影响因素更多，带来的不确定度超过了生产商的预估（学生物的，尤其是分子生物学的人喜欢用艾本德，不喜欢大龙的原因也是这样），这就导致了稀释后样本结果不超过线性范围上限的情况发生。但即使生产商已经充分考虑到稀释引入的不确定度增加的问题，也会有一定概率（比如5%）的该类情况出现。所以各位操作者也没必要对此类情况产生误判，认为测量系统有问题，这是一个现实情况，难以避免！

同时在选择稀释度上，应该考虑到超过线性范围上限的样本稀释后的原始结果应该落入AMI的区间内，不应该低于LLOQ。否则会造成换算后的浓度严重偏倚。这也是生产商在应该在其制造时应该考虑到的问题，在其声明的稀释倍数中应该注明该问题。

可报告范围验证方案

一、样本选择

样本基质应与临床实验样本相似，但不可采用含有对测量方法具有明确干扰作用物质的样本，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样本。以血清样本为例。

二、样本准备

低值样本准备：将待测样本（含被分析物）用混合人血清（含被分析物浓度水平较低）或 5% 牛血清白蛋白生理盐水溶液进行稀释，产生接近于方法测量区间低限（定量下限）浓度水平的样本，通常为 3 ～ 5 个浓度水平，浓度间隔应小于测量区间低限的 20% 。

高值样本准备：使用混合血清或 5% 牛血清白蛋白生理盐水溶液或测定方法要求的稀释液对高值待测样本（必要时可添加被分析物，并计算出理论值）进行稀释，使其接近于线性范围的上 1/3 区域内，并记录稀释倍数。稀释倍数应为方法性能标明的最大稀释倍数并适当增加或减小稀释比例。

三、样本例数选择

应至少使用 3 份测量区间内高值样本进行实验。

四、稀释液的准备

应选择经基质效应验证后，厂家认为其基质效应满足临床需求且易于临床获取的稀释液，推荐优先使用厂家商品化配套稀释液、生理盐水或含蛋白的缓冲溶液，亦可选择经过处理的真实低值样本作为稀释液。

五、样本测定

样本测量时，应尽可能在一个批次中完成。将每个低值样本重复测定 5 ～ 10 次，每个高值，对原倍样本及各稀释比例样本各重复测量 3 次，记录结果。

样本测量前仍需进行相应的质控程序，以确保分析系统的稳定性。

注：EP文件中会充分考虑到手工稀释引入的不确定度，建议其在验证手工稀释时，由两名及以上操作人员对同一样本进行稀释操作，以验证人员操作带来的不确定度。

六、数据分析

性能验证专题（六）：可报告范围

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