导读：目前，脓毒症是引起重症监护室患者死亡的主要原因，其发病机制至今尚未完全阐明。铁死亡（即铁依赖性细胞死亡、铁下垂）对于脓毒症发病起着关键作用，这表明铁死亡相关基因可能成为潜在的治疗靶点。该研究旨在鉴定脓毒症中与铁死亡相关的关键基因，并探索靶向治疗方法。通过对公共数据集的差异表达分析，血红素加氧酶-1（HO-1）被鉴定为与铁死亡相关的关键基因。此外，GSE175453数据集的单细胞分析显示，脓毒症期间单核细胞谱系中HO-1表达显著上调。实验采用盲肠结扎和穿刺（CLP）方法建立小鼠脓血症模型，其肺和肠组织表现出典型的铁死亡特征，且HO-1表达显著增加。而用HO-1抑制剂锌原卟啉（ZNPP）治疗显著改善了CLP诱导的肺和肠组织以及脂多糖（LPS）诱导的THP-1细胞中的铁死亡。随后，分子对接、表面等离子体共振和微尺度热泳实验表明，人参皂苷Rb1能够特异性靶向HO-1。最后，在体外和体内进行验证，发现人参皂苷Rb1显著降低了HO-1的表达，抑制了脓毒症小鼠和THP-1细胞的铁死亡，并改善了小鼠的肺和肠损伤。总之，该研究将HO-1确定为脓毒症中铁死亡的关键靶点，并建议人参皂苷Rb1作为治疗脓毒症诱导的器官功能障碍的潜在新型HO-1抑制剂。各位同学大家好！今天分享的文献是在2025年1月刚刚发表在SCI期刊Free Radical Biology and Medicine上（IF = 7.1, 中科院一区、JCR Q1区）的一篇中药单体通过影响机体铁死亡改善脓毒症的论文，该研究以铁死亡为切入点，结合了公共数据挖掘及其验证，对人参皂苷Rb1抗脓毒症的药效学及分子机制进行了探讨，下面请与我一同学习吧：
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脓毒症是宿主对感染反应失调所导致的器官功能障碍综合症，严重的脓毒症可发展为脓毒性休克，严重危及患者生命。同时，脓毒症也是各类创伤性和非传染疾病的并发症。在2017年，全球范围内脓毒症发病逾4890万例，导致超过1100万人死亡，占全球总死亡率的19.7%。目前，对于脓毒症的治疗主要集中于控制感染和使用抗生素，但脓毒症持续高发且死亡率较高，仍为全球医疗保健系统带来巨大挑战。
在脓毒症的发生与发展过程中，铁死亡似乎扮演着重要角色，且针对铁死亡相关基因（Ferroptosis-related genes, FRG）的研究逐渐展露了其在脓毒症诊断、预防和治疗中的潜在价值。有别于细胞凋亡、细胞自噬等细胞程序性死亡方式，铁死亡是一种铁依赖性的新型细胞死亡方式，其机制主要在于，在二价铁或酯氧合酶的作用下，细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生过氧化，这个过程会破坏细胞膜的完整性，进而诱导细胞死亡。
人参皂苷Rb1是传统中药人参中的一类化学成分，因其较强的生物活性而被国内外研究者广泛关注。近期有研究发现，人参皂苷Rb1可抑制脂质过氧化，在机体缺血、缺氧的条件下提供神经保护；此外，该成分也被证明可通过抑制铁死亡来减轻由阿奇霉素诱导的心脏毒性。同时，人参皂苷Rb1也显示出良好的脓毒症治疗效果，可显著提升脓毒症大鼠的存活率，并下调一些促进炎症反应的基因，如TNF-α等。然而，人参皂苷Rb1是否能通过抑制铁死亡来治疗脓毒症，以及通过怎样的信号分子发挥作用尚不清楚，而相关研究可为推广Rb1治疗脓毒症提供更多有价值的参考。
2、通过公共数据挖掘发现HO-1可作为影响脓毒症重要的FRG研究者首先希望聚焦于某一FRG进行研究，并以此作为研究的切入点，这里使用的是老生常谈的公共数据挖掘的分析方法。研究者选取了GSE13904和GSE26440两个数据集，其中GSE13904是一项基于微阵列的前瞻性研究，检测了全身性炎症反应、脓毒症、脓毒休克危重患儿及健康对照的全血基因表达谱，所使用的检测平台是GPL570 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array；而GSE26440则是比较了98例脓毒休克儿童和32例健康对照的全血基因表达谱，同样为微阵列检测，所用检测平台与上述平台相同。
研究者分别挑选出了在脓毒症患者全血样本中显著上调和下调的基因，再通过FerrDb数据库和GeneCards数据库收集FRG，分别将这些基因求取交集，达到筛选影响脓毒症重要FRG的目的。经分析发现，在GSE13904和GSE26440两个数据集中，脓毒症患者显著上调的差异表达基因与数据库中的FRG有47个重合，提示这47个基因可重点关注。
进一步地，研究者利用这47个基因构建人工神经网络，并利用ROC曲线评估模型的预测性能。结果在GSE13904和GSE26440的训练和测试集中，曲线下面积值（Area under the curve, AUG）分别为0.997、0.507、1.000和0.717。在训练集和测试集之间AUC值的显著变化表明，由这47个基因所构建的模型存在过拟合。
接着通过STRING构建蛋白互作网络，筛选那些高Degree值的FRG，发现HO-1基因Degree值最高，即在蛋白互作网络中可能发挥关键作用。而后将对HO-1基因进行ROC分析，发现其在GSE13904和GSE26440的训练和测试集中AUC值分别为0.780、0.750、0.774和0.821，表明铁死亡相关基因HO-1很可能作为一个显著的脓毒症生物标志物发挥作用。
图1：通过公共数据集鉴定与分析潜在的FRG
3、通过挖掘公共数据库中单细胞转录组测序的数据进一步表征HO-1与脓毒症的关联性研究者选取了单细胞转录组测序数据集GSE175453进行分析。该数据集纳入了4名重度脓毒症患者和5名健康受试者全血样本的测序数据，所使用到的测序平台有GPL18573 Illumina NextSeq 500 (Homo sapiens)和GPL24676 Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens)。
通过tSNE聚类分析，样本中的若干细胞亚群被区分开，如T细胞、NK细胞、单核细胞、B细胞、中性粒细胞等等。结果发现HO-1在单核细胞亚群内具有显著的高表达，同时研究者也注意到了TLR4、MAPK14等基因也在该亚群中高表达，这些结果提示HO-1基因与脓毒症的关联很有可能与单核细胞功能密切相关，且涉及到了TLR4、MAPK14等基因。
图2：单细胞转录组测序进一步揭示HO-1与单核细胞、脓毒症的关联性
4、通过KEGG、GO和GSEA富集分析等进行HO-1的单基因脓毒症分析既然HO-1已经确认作为重点FRG予以关注，那么研究者就在上面所提到的脓毒症数据集GSE13904和GSE26440中以HO-1的表达水平为依据进行分组，即分为HO-1高表达和低表达组，并分析这两组间的差异表达基因。对所得到的基因进行生物富集分析发现，富集的KEGG通路包括补体和凝血级联、吞噬溶酶体形成、中性粒细胞细胞外陷阱形成和toll样受体信号转导、B细胞受体信号传导等等，这进一步强化了HO-1很有可能在脓毒症的发生与发展中发挥关键作用，GO和GSEA分析结果也是类似。
接着，研究者通过聚类分析、GSVA分析、免疫浸润分析等手段解析脓毒症患者FRG相关的免疫特征，发现HO-1可能是脓毒症相关免疫反应的关键调节因子，通过调控许多免疫相关途径来实现其功能，相关内容此处就不再赘述。
图3：基于生物富集分析的HO-1单基因脓毒症解析
5、盲肠结扎穿刺（Cecal ligation and puncture, CLP）诱导了小鼠肺和肠组织中铁死亡的发生研究者利用CLP特异性诱导了小鼠脓毒症模型，同时添加了Fer-1（一种铁死亡抑制剂）组，以比较铁死亡在脓毒症进展过程中所发挥的作用。HE染色结果显示CLP处理的小鼠肺和肠出现明显的组织病理学变化，而Fer-1处理后这些变化得到改善。对血清促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β检测的结果，以及对肺和肠MDA和亚铁离子的检测结果，都呈现出与上述相同的变化。在抗氧化方面，通过检测GSH发现CLP处理后机体抗氧化能力减弱，而Fer-1处理后则得到恢复。
此外，利用Western Blot和qRT-PCR检测了一些与铁死亡相关的marker，如PTGS2等，结果均符合预期。这些结果提示了铁死亡在CLP引起的脓毒症中发挥重要作用，可引起肺和肠组织的损伤，而抑制铁死亡有助于减轻这些损伤。
图4：CLP诱导小鼠肺和肠组织的铁死亡
在阐明了铁死亡与脓毒症的密切关系之后，研究者进一步聚焦了上述临床数据挖掘得到的关键基因HO-1。这里使用到了HO-1的特异性小分子抑制剂Znpp，研究者仍然通过组织病理学检查、血清炎症因子和血生化检测、Western Blot和qRT-PCR检测铁死亡相关基因等手段，阐明了由CLP所引起的铁死亡加剧可被Znpp保护，即抑制HO-1可显著缓解由脓毒症所引起的铁死亡。
图5：靶向HO-1可减轻脓毒症小鼠的铁死亡
7、人参皂苷Rb1可直接结合HO-1并减轻铁死亡最终改善脓毒症研究者首先假设，人参皂苷Rb1对脓毒症的改善作用很有可能是通过结合HO-1并影响铁死亡来实现的，因此首先通过分子对接、表面等离子体共振和微尺度热泳证明人参皂苷Rb1可与HO-1实现稳定结合。
接着，研究者对CLP诱导的脓毒症小鼠给予人参皂苷Rb1治疗，发现该天然产物可显著改善由脓毒症引起的铁死亡，所用的检测手段及其指标与上述第6部分基本相同，不再赘述。
由于在第3部分的单细胞转录组测序分析中，研究者发现HO-1可能与单核细胞关系较为密切，因此进一步选取了THP-1人单核细胞白血病细胞系开展研究。简单来讲，THP-1细胞在经LPS刺激后HO-1显著上调，且细胞铁死亡加重，而给予人参皂苷Rb1给药后，THP-1细胞的HO-1水平降低，且由LPS所诱导的铁死亡得到显著抑制。
图6：人参皂苷Rb1可与HO-1实现特异性结合
图7：人参皂苷Rb1可通过结合HO-1减轻铁死亡，最终改善脓毒症该研究从一些临床数据集出发，挖掘到了与脓毒症相关的铁死亡关键基因HO-1，进一步构建小鼠脓毒症模型，并通过分子对接、表面等离子共振和微尺度热电泳检测人参皂苷Rb1与HO-1蛋白的结合特异性，证明了人参皂苷Rb1可直接结合HO-1并减轻铁死亡，最终改善脓毒症，这可能与单核细胞功能密切相关。文章对于公共数据的挖掘得当，做出了明确的表型并对人参皂苷Rb1治疗脓毒症的分子机制提供重要参考，内容十分详实。存在的一些小瑕疵可能在于表型部分的篇幅占比较大，还没说清人参皂苷Rb1结合单核细胞HO-1后如何调控铁死亡，如果该部分已经有较多文献报道，则创新性会稍有降低。总的来讲，该文章质量高、工作足，值得我们学习。
图8：该文献的总体研究框架
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参考文献：
He, S., Ye, H., Wang, Q., He, Y., Liu, X., Song, J., Zhao, C., Hu, Y., Luo, L., Guo, Y., & Liu, Q. (2025). Ginsenoside Rb1 targets to HO-1 to improve sepsis by inhibiting ferroptosis. Free radical biology & medicine, 226, 13–28. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2024.11.007
