1.柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11.5的柱子。
2.填料的端基封尾(或称封口)
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应。
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a.含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
b.流动相要求使用0.45 μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
1. 色谱柱的平衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!操作步骤：
a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡)
b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。
2. 色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降(柱子的理论塔板数减低)。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。
建议用来冲洗柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-4mm 1.6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml
选择再生方法：
极性固定相(如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料)的再生：
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相(如反相色谱填料RP-18，RP-8，CN等)的再生：水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水
注意：
a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
3. 色谱柱使用过程中常见问题的解决
高效液相色谱柱在使用过程中最容易碰到的问题就是柱压升高。如果柱压是在长时间使用过程中缓慢地增加,通常这属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞除外）,可能的原因有如下几点：
色谱柱头中过滤筛板 （图1）中的2#部件污染
色谱柱头内的填料被污染
色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂, 形成结晶析出
流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解,解决方法如下:
当断定是色谱柱头中过滤筛板污染时,可将柱头螺丝卸下, 取出过滤筛板, 并将其放置在30%左右的稀硝酸内,用超声波超声清洗约10分钟后,再用超纯水超声约10分钟, 重新装人色谱柱内
当断定是色谱柱头内的填料被污染时,可将柱头螺丝卸下用专用小匙挖出柱内前段被污染的填料, 用相同的柱填料重新填人,仔细修复后重新安装上柱头螺丝,或以能溶解污染物的流动相,按色谱柱使用的相反方向,冲洗色谱柱（流动相的冲洗量为20至30倍色谱柱体积或视具体情况而定）。另外,此时最好不要连接检测器, 将污染物冲出色谱柱, 再按色谱柱标明的箭头方向使用色谱柱上箭头方向说明色谱评价是按此方向价。 因此使用时最好按此方向价。
当断定是盐结晶时,用水冲洗色谱柱,使柱内盐全部溶解并被冲洗出色谱柱, 再换用含高浓度甲醇或其他有机溶剂的流动相
如果是因使用的流动相PH值控制不当,通常很难将色谱柱恢复。 有一点必须注意一旦色谱柱头被打开,即便是经过很仔细地修复都很难恢复到原有新柱水平。
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