夏老师在 PubMed 上检索线粒体代谢重编程相关资料时，偶然发现了一篇颇有意思的文章。该文章由南方医科大学和清华大学的博士，合作发表于影响因子高达 14.7 分的 Nature 子刊
Nature Communications
。这篇文章在逻辑和推理上，处处显示出科研应该有的样子（
科研的推理和逻辑其实是一篇文章中最重要的，通过提出假设→实验验证→假设迭代，不断读推进课题，这样才能得到一篇较为完整的文章，不清楚的科研推理的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）
这篇文章为何聚焦于 AKT 信号通路与 ME2（苹果酸酶 2）之间的关联呢？这得追溯到他们早年发表在影响因子 64.8 分的
Nature
上的一篇文章，那篇文章研究的是 p53 与苹果酸酶之间的关系。或许有人会疑惑，这与 AKT 又有什么联系呢？（
熟悉 p53 信号通路的研究者，想必对 p53 的下游基因有所了解，
p53 最经典的下游基因是 PTEN，
若不太清楚这些信号通路的话，不妨回顾一下《信号通路是什么鬼？》系列进行复习
）。
研究人员首先分析了 PTEN 缺失后（从某种程度上也可理解为 p53 缺失）ME2 的表达和定位情况。ME2 作为参与三羧酸（TCA）循环的关键酶，正常情况下其定位在线粒体。然而，当 PTEN 缺失时，ME2 的线粒体定位显著下降，而细胞质定位却明显增加。此时，PTEN 主要调节的下游基因 AKT 进入了研究人员的视野（
至于 AKT 为何是 PTEN 的下游基因，如果你同时也还记得PI3K-AKT信号通路的话，应该知道PTEN所抑制的PIP2→PIP3的过程，和PI3K-AKT信号通路密切相关，不记得的话，可回顾《信号通路是什么鬼？》系列中关于 PI3K - AKT 信号通路的内容
）。研究人员在敲减 PTEN 后，使用 AKT 的抑制剂，成功恢复了 ME2 的线粒体定位。
大家是否还记得 PTEN 是如何调控 AKT 的呢？PTEN 实际上是抑制 PIP2 向 PIP3 的转化过程，使得 AKT 无法被磷酸化激活。
那么，AKT 又是如何促使 ME2 定位到细胞质而非线粒体的呢？研究人员将 ME2 进行分段处理，分为 ME2fl（ME2 全长）和 ME2m（
ME2 线粒体定位形式，缺失 N 端 18 个氨基酸，这其实也是对 ME2 的柯霍氏法则的验证，通过这样的缺失分析，来验证对于表型的影响，这里就是通过缺失N段氨基酸残基，来分析线粒体影响，若不太明白，可以看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》
）。结果发现，AKT1 能够与 ME2fl 结合，导致 ME2 的 N 末端 Ser9 磷酸化，进而使得 ME2fl 无法定位到线粒体。
AKT1 激活了 ME2fl 的 Ser9 氨基酸的磷酸化。研究人员通过对 ME2fl 的该磷酸化位点进行突变，即构建 S9A 和 S9D 突变体（
A 模拟失活磷酸化，D 模拟激活磷酸化，相较于普通的柯霍氏法则验证，这种方式更为全面严谨，由于将命题中概念的外延范围缩小到了磷酸化位点变化对于下游机制的影响，也就避免了肯定后件的逻辑谬误，若不了解命题的外延和肯定后件逻辑谬误的话，可参考《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。结果显示，ME2fl 的 Ser9 位点的磷酸化激活，能够提高 ME2 对底物的结合能力，增强其酶活性。
同样，对于 AKT1 激活的 ME2fl 的 Ser9 氨基酸的磷酸化对 ME2 定位的影响，研究人员也利用 ME2fl 的 S9A 和 S9D 突变体进行验证。结果表明，ME2 的 Ser9 位点的磷酸化激活，确实会导致 ME2 的定位更倾向于细胞质。
这篇文章的研究起始点是 PTEN 的缺失。细胞中的 PTEN 沉默会导致糖酵解增加，TCA 循环活性降低。ME2 作为参与 TCA 循环的酶，极有可能参与了 PTEN 缺失后的代谢重置过程。ME2 磷酸化激活后的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）数据显示（
见下图红框部分，ECAR和OCR主要是Seahorse实验，分析有氧呼吸或糖酵解情况变化的，关于该图的解读在《信号通路是什么鬼？》系列的铜死亡相关章节已有讲解，可回顾复习
），ME2 磷酸化激活后，会损害细胞的氧化磷酸化，诱导线粒体呼吸向糖酵解活性的代谢转换。
那么，ME2fl 被 AKT1 磷酸化激活后，又是如何促进糖酵解活性的呢？研究发现，ME2fl 可与 PFKL、GAPDH、PKM2 和 LDHA 等多种糖酵解酶形成复合物。当 ME2fl 被 AKT1 磷酸化激活后，会在细胞内组装这些糖酵解复合物，从而提高糖酵解的催化效率。
ME2fl 的 Ser9 的磷酸化，还会促进肿瘤进展表型。研究人员依旧采用 ME2fl 的 S9A 和 S9D 突变体进行验证，这种方式有效避免了中项不周延或者肯定后件的逻辑漏洞（
肯定后件和中项不周延，其实都是由于概念的外延不明确所导致的，如果不了解中项不周延和肯定后件的概念，可查阅《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。由此证明，AKT1 对 ME2fl 的 Ser9 位点磷酸化，是促进肿瘤在体内、外增殖的关键因素。
最后，研究人员构建了如下示意图：在 PTEN 缺失的情况下，AKT1 被激活，激活后的 AKT1 对 ME2fl 进行 Ser9 位点的磷酸化，导致 ME2fl 无法定位到线粒体，进而无法促进 TCA 循环。磷酸化的 ME2fl 会定位到细胞质中，与糖酵解相关的酶形成复合体，促使细胞的代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，最终促进肿瘤增殖。
这篇文章在逻辑验证方面，仅针对 AKT1 对 ME2fl 的 Ser9 的磷酸化这一论点展开，并未探讨 AKT1 和 ME2fl 的表达所产生的影响。仅这一点，就已经超越了大多数文献。大家对这样的论证有何见解呢？欢迎在评论区与夏老师互动交流。好了，今天的分享就先到这里。如果大家感兴趣，强烈推荐阅读原文，希望大家都能从中学有所获，在科研道路上心明眼亮。
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