肿瘤细胞通常处于乏氧的微环境中，而乏氧迫使肿瘤细胞代谢重编程来维持肿瘤细胞的无限增殖以及避免由NADH堆积，也称为还原应激，导致的细胞死亡。在前期研究中，作者对细胞发生代谢重编程的规律进行了总结，提出代谢反应中底物与产物的电子势能决定着代谢重编程如何进行（J Exp Med, PMID: 31961917）。经过理论模型预测，肿瘤细胞可以发生由葡萄糖起始的甘油合成和分泌途径的代谢重编程，并且可能对乏氧条件下肿瘤细胞的增殖发挥关键作用，然而其具体调控机制和生理功能尚不清楚。
2025年1月2日，首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所李兵辉课题组在Nature Cell Biology长文发表了题为AMPK-regulated glycerol excretion
maintains metabolic crosstalk between reductive and energetic stress的研究成果。此工作发现乏氧诱导的NADH堆积可以显著的促进甘油的合成与分泌，而甘油的分泌可以持续消耗NADH，缓解肿瘤细胞内还原应激及其引起的生长抑制。同时，乏氧条件下甘油的过度分泌又可引起ATP的耗竭，引发能量应激，激活AMPK对甘油的合成与分泌进行限制。因此甘油的合成与分泌可以调节还原应激和能量应激之间的平衡，并且这种调节模式在还原应激驱动的代谢重编程中普遍存在。该工作有助于我们更好地理解代谢的复杂性，并为肿瘤治疗提供新思路。
首先，通过代谢组学以及代谢质谱分析发现，乏氧条件下，肿瘤细胞中由葡萄糖来源的甘油生物合成和分泌显著增加，并且在多种细胞类型中都可以观察到这一现象。在HeLa细胞中敲除与甘油合成相关的GPD1、GPD1L或3-磷酸甘油磷酸酶（PGP）基因，观察对甘油分泌以及肿瘤细胞生长的影响，发现敲除这些基因都会显著抑制乏氧下的甘油分泌和细胞增殖，回补这些敲除的基因，表型则能得到恢复。此外，收集肿瘤携带小鼠的血清以及宫颈癌、肺癌和肝癌患者的血清进行检测，可以观察到血清甘油水平明显高于健康对照组。说明乏氧通过促进甘油的生物合成和分泌维持肿瘤细胞生长。
那么为什么会发生这种现象呢？由于乏氧会增加细胞内NADH/NAD+比例，并且由葡萄糖来源的甘油合成能消耗NADH，作者猜想甘油的生物合成和分泌是否在维持NADH/NAD+的平衡中发挥重要作用。通过抑制或表达甘油分泌相关代谢酶，作者发现抑制甘油分泌能进一步加剧细胞内NADH的堆积，而增加甘油分泌能够进一步减少细胞内NADH还原压力的产生。同时，对细胞内NADH进行干预同样发现NADH堆积能够引起甘油分泌的增加，缓解NADH还原压力能够显著的减少甘油的合成与分泌。这些结果表明乏氧诱导的NADH堆积驱动甘油的生物合成和分泌，而甘油的分泌又可缓解细胞内的NADH还原压力。
与此同时，作者观察到在乏氧条件下甘油的分泌远胜于呼吸链抑制（ETC抑制）引起的甘油分泌，尽管他们所诱导的NADH堆积的程度相当。这些结果提示乏氧还通过其他途径促进甘油分泌。考虑到低氧诱导因子（HIF1α）在乏氧下发挥着重要的调控作用，作者对HIF1α以及与甘油合成分泌相关的蛋白进行检测，实验发现HIF1α以及其调控的己糖激酶（HK2）和葡萄糖转运蛋白（GLUT1）都参与调节甘油的合成和分泌，揭示了HIF1α通过增强葡萄糖的摄取促进乏氧诱导的甘油分泌，当与NADH堆积联合时，有协同增强效应。至此，作者已经证明乏氧同时通过稳定缺氧诱导因子 HIF1α的表达和NADH 堆积显著促进甘油的合成和分泌。
抑制乏氧下的甘油分泌对肿瘤细胞生长是不利的，那么甘油分泌增高对肿瘤细胞在乏氧环境下的生存有怎样的影响呢？为了探究这一问题，作者在HeLa和A549细胞中分别过表达GPD1，GPD1L或PGP来增加甘油分泌，通过体内体外实验检测对肿瘤细胞生长的影响，结果表明过表达这些代谢酶明显增加了甘油的分泌，但是与抑制甘油分泌对细胞生长的影响一致，提高甘油的分泌同样显著抑制了乏氧条件下的肿瘤细胞的生长。抑制或者促进甘油分泌都能够抑制肿瘤细胞的生长，为了寻找这一矛盾现象的具体原因，作者发现甘油的过度分泌会引起葡萄糖的资源浪费（未进入能量代谢），从而引起能量应激以及AMPK的激活。因此，尽管甘油的生物合成和分泌对于肿瘤生长是必需的，但其过度合成也对肿瘤的生长不利。
对甘油的合成与分泌及其具体调控机制进行探索，作者发现，糖酵解的中间产物磷酸二羟丙酮（DHAP）作为3-磷酸甘油/甘油的前体物质，由三种醛缩酶催化生成，通过实验作者发现只有ALDOB参与调控甘油分泌。作者猜想ALDOB是否与下游甘油合成的相关代谢酶存在紧密联系。通过免疫共沉淀和体外下拉实验，证实了ALDOB通过与GPD1/GPD1L形成复合体参与甘油的生物合成。那么细胞是如何来调控甘油的生物合成呢？考虑到甘油过度合成会引起能量应激，激活AMPK信号通路，作者对AMPK是否调控甘油分泌进行检测。实验发现AMPK激活显著抑制了甘油的分泌，抑制AMPK则促进了甘油分泌。通过免疫共沉淀和体外激酶等实验，作者发现AMPK可以直接与ALDOB发生相互作用并磷酸化其Thr-245位点，抑制ALDOB的活性。此外，通过ALDOB的Thr-245位点突变的相关实验，进一步地证实了该位点的磷酸化对甘油分泌的影响。表明AMPK主要通过直接磷酸化ALDOB的T245位点来抑制其酶活性，从而减少甘油的分泌。
以上研究结果提示了NADH堆积通过代谢重编程引发能量应激的可能性，那么，NADH堆积是否在乏氧或ETC抑制引起的能量危机中发挥关键作用呢？作者在乏氧和ETC抑制的细胞中的确发现了能量应激，表现为AMPK和ACC1磷酸化水平升高，ATP/AMP比率降低。而使用α-酮丁酸（αKB）处理和LbNOX缓解细胞内NADH堆积又可以显著的恢复细胞内ATP/AMP的比率，减少AMPK和ACC1的磷酸化。提示NADH还原压力确实在乏氧和ETC抑制引起的能量应激中扮演着重要的作用。同时，利用mTOR信号通路的抑制剂雷帕霉素及Torin1对细胞代谢进行广谱的抑制，发现乏氧或ETC抑制引起的能量应激也得到了显著的营救，进一步提示在乏氧或者ETC抑制条件下，NADH堆积通过促进代谢重编程对NADH还原压力进行缓解，在此过程中消耗能量引起能量应激的发生。针对这一发现，作者提出ETC抑制与AMPK抑制的联合疗法，同时加剧肿瘤细胞中还原应激与能量应激的发生，可以显著的抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。
综上所述，作者发现了乏氧通过诱导NADH堆积和葡萄糖摄取，促进了甘油的生物合成和分泌，从而缓解还原应激。但这一过程也造成葡萄糖的资源浪费并消耗ATP，在乏氧条件下增加能量耗竭的风险。为了防止过度的ATP损失，肿瘤细胞通过AMPK介导的ALDOB磷酸化调节甘油合成，平衡还原应激和能量应激，从而维持肿瘤细胞在乏氧条件下的生存。该项研究揭示了还原应激与能量应激之间的代谢联系，为深入理解肿瘤代谢及寻找潜在的治疗方法提供了新的视角。
首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所李兵辉教授为本文的通讯作者，首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所翟雪炜博士后、阳荣辉博士后是本文的共同第一作者。首都医科大学褚巧云博士，首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所郭子豪博士后，侯彭姣博士等也为本研究做出了重要贡献。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41556-024-01549-x
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