基于网络药理学的四逆散保肝作用机制研究

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2020-12-28 08:08

正文

摘要：目的基于网络药理学探讨四逆散治疗慢性肝炎、脂肪肝与肝癌的物质基础和保肝的作用机制，同时揭示四逆散治疗肝病“异病同治”的分子机制。方法利用 TCMSP 、 CTD 、 Genecards 、 Omim 等数据库与相关文献检索四逆散有效化学成分、靶点和慢性肝炎、脂肪肝、肝癌疾病靶点；利用 TBtools 软件获取四逆散保肝作用的潜在靶点；利用 Cytoscape 3.7.2 软件构建“有效化学成分 - 靶点”网络与潜在靶点蛋白互作网络；利用 Uniprot 数据库对潜在靶点进行注释；利用 David 数据库对潜在靶点进行基因本体（ GO ）生物功能与基因组百科全书（ KEGG ）通路富集分析。结果共获取四逆散有效化学成分 137 个、靶点 223 个，慢性肝炎靶点 478 个，脂肪肝靶点 17 277 个，肝癌靶点 16 930 个，四逆散保肝作用的潜在靶点 30 个。 GO 生物功能与 KEGG 通路富集分析显示潜在靶点共涉及 178 个生物过程，参与 51 条信号通路，排名前 20 的通路中与肝病相关的有 9 条。结论四逆散可能是通过调控 IL-6 、 VEGFA 、 EGFR 、 PPARG 、 CASP3 等潜在靶点和 HIF-1 、 TNF 、 PI3K-Akt 等相关信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激、抑制细胞凋亡等功能，从而对肝脏起到保护作用。

四逆散是由柴胡、白芍、枳实、甘草 4 味中药组成的方剂，首载于《伤寒论》。本方原治阳郁厥逆证，《伤寒论 · 辨少阴病脉证并治》中记载“少阴病，四逆，其人或咳，或悸，或小便不利，或腹中痛，或泄利下重者，四逆散主之”，后经世代医家传承总结，多用作疏肝健脾的基础方，附方亦有柴胡疏肝散、枳实芍药散等。四逆散方中柴胡疏肝解郁、升发阳气，为君；白芍敛阴养血、调达肝气，为臣；枳实理气解郁、泄热破结，为佐；甘草调和诸药、和中健脾，为使，四药合用，共奏疏肝健脾之功。四逆散临床多用于治疗消化系统、肝胆、妇科、泌尿系男科、儿科、神经系统、内分泌、外科等疾病，疗效确切，效果显著 ^[1] 。现代药理学研究表明，四逆散具有改善肝纤维化程度、降低血清内毒素、调节基质降解、抑制肝癌细胞增殖等作用，在治疗脂肪肝、慢性肝炎、肝癌等肝脏疾病过程中，对肝脏具有保护作用 ^[2-5] 。目前肝病致死人数在世界死亡总人数中约占 7.9% ^[6] ，由于现有治疗方法效果不佳，临床中仍需新型有效的肝病防治药物，保肝药物的研究与开发具有广阔的科研和应用价值。

近年来，人们引入了网络药理学系统评估中药的药理作用，进而探索中药发挥药效的分子机制。通过对分子间相互作用网络和相关数据等进行可视化分析，研究人员可以全面系统地识别中药的靶蛋白并评估其对疾病的影响 ^[7-9] 。吴丹等 ^[10] 采用网络药理学方法探究了逍遥散治疗抑郁症与糖尿病“异病同治”的作用机制；何信用等 ^[11] 应用网络药理学探究了黄连解毒汤治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制；郑罗棋等 ^[12] 通过网络药理学探究了吴茱萸致毒性的潜在分子机制。因此，基于网络的筛选在中药的二次开发和机制预测方面具有重要意义。本研究以目前已鉴定的四逆散中药物有效活性成分和潜在的肝病靶点为基础，进行四逆散的网络药理学研究，探究四逆散保肝的作用机制，旨为中医异病同治理论提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 四逆散有效化学成分与靶点的收集

在 TCMSP （ http://tcmspw.com/tcmsp.php ）数据库中检索四逆散方剂组成药物柴胡、白芍、枳实、甘草的有效化学成分及成分相应靶点，筛选条件为“口服利用度（ oral bioavailability ， OB ）≥ 30% ”“药物相似性（ drug likeness ， DL ）≥ 0.18 ”，查阅文献，对四逆散有效成分和靶点进行补充。

1.2 四逆散 “ 化学成分 - 靶点 ” 网络的构建

将四逆散化学成分与靶点信息导入 Cytoscape 3.7.2 软件中，对各药物化学成分进行形状、颜色识别标注，化学成分与靶点的关系用边表示，并基于介数中心性（ betweenness centrality ， BC ）、接近中心性（ closeness centrality ， CCL ）、集聚系数（ clustring coefficient ， CCF ）、度值、节点邻居的平均连接度（ neighborthood connectivity ， NC ）对该网络进行拓扑学分析。

1.3 疾病靶点的收集

在 CTD （ http://ctdbase.org ）、 Genecards （ https:// www.genecards.org ）、 Omim （ https://omim.org ）数据库中检索关键词“ fatty liver ”“ chronic hepatitis ”“ liver cancer ”以收集脂肪肝、慢性肝炎和肝癌疾病靶点。在 CTD 与 Genecards 数据库检索结果中分别选择推理分数（ inference score ）＞ 20 、关联分数（ relevance score ）＞ 20 的疾病靶点。查阅文献，对疾病靶点进行补充。

1.4 四逆散保肝作用潜在靶点的处理

利用 TBtools 软件对四逆散靶点与疾病靶点进行交集比对，将四逆散治疗脂肪肝、慢性肝炎、肝癌 3 种疾病的靶点作为四逆散保肝作用的潜在靶点。利用 Uniprot 数据库（ https://www.uniprot.org ）对潜在靶点进行注释。将保肝作用潜在靶点信息导入 STRING 数据库（ https://string-db.org ），得到保肝作用潜在靶点蛋白互作网络（ PPI ）信息表，进一步将表中数据导入 Cytoscape 软件中，构建潜在靶点 PPI 网络，并进行拓扑学分析。该网络中节点大小与度值呈正相关，节点之间连线的颜色深浅、粗细程度与结合分数呈正相关。

1.5 基因本体 （ GO ）生物功能与百科全书基因组 （ KEGG ）通路富集分析

将保肝作用潜在靶点信息导入 Divid 数据库（ https://david.ncifcrf.gov ），分别勾选生物过程（ biological process ， BP ）、分子功能（ molecular function ， MF ）、细胞组成（ cellularcomponent ， CC ）、 KEGG 信号通路（ KEGG pathways ），得到潜在靶点的 GO 生物功能与 KEGG 通路富集分析结果。

2 结果

2.1 四逆散有效成分

如表 1 所示， TCMSP 数据库和文献共收集整理四逆散有效成分 137 个，包括来自柴胡 17 个、白芍 13 个、枳实 22 个、甘草 92 个，其中山柰酚（ kaempferol ）为柴胡、白芍、甘草共有有效成分，异鼠李素（ isorhamnetin ）、槲皮素（ quercetin ）为柴胡、甘草共有有效成分，白桦脂酸（ mairin ）、谷甾醇（ sitosterol ）为白芍、甘草共有有效成分，柚皮素（ naringenin ）为枳实、甘草共有有效成分。

2.2 四逆散 “ 有效成分 - 靶点 ” 网络

经数据库检索和文献补充，共获取四逆散靶点 223 个，包括柴胡 94 个、白芍 44 个、枳实 52 个、甘草 105 个。四逆散“有效化学成分 - 靶点”网络见图 1 。该网络中共有 1 783 条边， 336 个节点，包括来自有效成分节点 113 个、四逆散靶点节点 223 个，其中上方环形区域由内至外的节点依次为白芍、柴胡、枳实、甘草的有效成分，右侧红色环形区域节点为药物共有的有效成分，下方浅蓝色方形区域节点为四逆散靶点，网络中未存在孤立节点，显示出良好的连通性。进一步对该网络进行拓扑学分析，如表 2 所示，平均每个化学成分与 9.24 个靶点相互作用， 28 个化学成分与 10 个以上的靶点相互作用，平均每个靶点与 9.01 个化学成分相互作用， 18 个靶点与 10 个以上的化学成分相互作用。度值排名前 3 位的化学成分为槲皮素（ MOL000098 ）、山柰酚（ MOL000422 ）、异鼠李素（ MOL000354 ），度值排名前 3 位的靶点为 ESR1 、 AR 、 PPARG 。

2.3 四逆散保肝作用的潜在靶点

经数据库检索和文献补充，共获取慢性肝炎靶点 478 个、脂肪肝靶点 17277 个、肝癌靶点 16 930 个。利用 TBtools 软件将四逆散靶点与疾病靶点进行交集比对，如图 2 所示，得到四逆散保肝作用的潜在靶点 30 个。四逆散保肝作用潜在靶点信息见表 3 。

2.4 四逆散保肝作用潜在靶点的 PPI 网络

进一步对该网络进行拓扑学分析，如图 3 所示，该网络 BC 为 0.02 、 CCL 为 0.62 、 CCF 为 0.73 、 NC 为 14.45 、度值中位数为 12 ，网络中未出现孤立节点，显示良好的连通性，度值大于中位数且排名前 5 的潜在靶点依次为白细胞介素 -6 （ IL-6 ）、血管内皮生长因子（ VEGFA ）、表皮生长因子受体（ EGFR ）、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （ PPARG ）、半胱氨酸蛋白酶 3 （ CASP3 ）。

2.5 GO 生物功能与 KEGG 通路富集分析

经 David 数据库分析， GO 生物功能富集结果显示，保肝作用潜在靶点总计涉及 178 个生物过程（ P ＜ 0.05 ），属于 BP 的有 126 个，包括对药物的反应、凋亡过程的负调控、肝再生、基因表达的正调控、细胞对 IL-1 的反应等；属于 CC 的有 19 个，包括胞质溶胶、细胞外空间、细胞内膜结合细胞器、细胞质、脂筏等；属于 MF 的有 33 个，包括酶结合、转录因子结合、相同的蛋白质结合、蛋白质异二聚活性、蛋白质复合物结合等。 GO 生物功能富集结果排名前 20 的条目见表 4 。

KEGG 通路富集分析结果显示，潜在靶点总计参与 51 条信号通路（ P ＜ 0.05 ），包括乙肝、癌症的途径、缺氧诱导因子 -1 （ HIF-1 ）信号通路、肿瘤坏死因子（ TNF ）信号通路、人类 T 淋巴细胞白血病病毒 -1 （ HTLV-I ）感染等。在排名前 20 的通路中与肝病相关的有 9 条，包括乙肝、癌症通路、 HIF-1 信号通路、 TNF 信号通路、细胞凋亡、 Toll 样受体信号通路、蛋白聚糖在癌症中、 NOD 样受体信号通路、磷脂酰肌醇 3- 激酶 - 蛋白激酶 B （ PI3K-Akt ）信号通路。 KEGG 通路富集分析结果排名前 20 的条目见表 5 。

3 讨论

肝脏在代谢、排毒、消化和维持体内平衡方面起着至关重要的作用。我国大约有 3 亿人受各类肝病困扰，针对肝病的预防与治疗一直是公共卫生领域的热门话题 ^[13] 。慢性肝炎、脂肪肝、肝癌是 3 个具有代表性的肝脏疾病，共同表现为产生慢性炎症，肝伤口愈合反应异常，出现肝纤维化，进而导致肝细胞损伤、肝脏正常功能失调，最终肝功能衰竭 ^[14] 。中医理论认为脂肪肝、慢性肝炎、肝癌病位在肝，且与脾脏密不可分，病因包括饮食不节、情志失调、外感湿热疫毒等，日久则伤及肝脾，以致肝失疏泄、脾失健运、痰浊内生、阻滞气机、痰瘀互结而发病，病机以肝郁脾虚为主，故疏肝健脾、透邪解郁之法在疾病的治疗过程中尤为重要 ^[15-17] 。四逆散中柴胡升清，枳实降浊，君臣互用，肝脾调和、气机和畅；白芍补阴，兼以敛脾，与甘草合用，酸甘化阴、柔肝滋脾；四药并用，既可疏肝健脾，亦可透邪解郁，达到扶正祛邪的目的 ^[18] ，这在理论上解释了四逆散在临床上用于脂肪肝、慢性肝炎、肝癌“异病同治”的原因。

本研究利用“有效成分 - 靶点”网络分析了四逆散中柴胡、白芍、枳实、甘草的有效成分，进一步研究了化学成分与靶点之间的相互作用关系。该网络中度值排名前 3 位的化学成分依次为槲皮素、山柰酚、异鼠李素，同属黄酮类。槲皮素与异鼠李素是柴胡、甘草中的有效成分，具有多种生物和药理活性，包括抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡等 ^[19-20] 。 Yang 等 ^[21] 研究显示，槲皮素可降低血清转氨酶水平，减少 2 型糖尿病诱导的肝脏组织学改变，恢复肝脏中关键酶水平，减少 db/db 小鼠肝脏中的脂质蓄积，促进非酒精性脂肪肝的恢复。此外，槲皮素有强大的活性氧（ ROS ）清洗功能，可以降低中、高浓度 ROS 产生的氧化应激反应，抑制细胞凋亡或坏死，减缓肝脏肿瘤细胞的增殖速度 ^[20,22] 。 Wu 等 ^[23] 研究发现槲皮素可下调 Janus 激酶 2 （ JAK2 ）和信号传导和转录激活剂 3 （ STAT3 ）水平，干扰 LM3 细胞的增殖和细胞周期分布，诱导细胞凋亡，抑制肝细胞癌的增殖分化。异鼠李素可以通过诱导巨噬细胞血红素氧合酶 -1 （ HO-1 ）表达来降低脂多糖诱导的 ROS 产生、线粒体功能障碍和细胞凋亡 ^[24-25] 。异鼠李素可以显著阻止四氯化碳（ CCl ₄ ）诱导的血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平的升高，降低磷酸化 Smad 蛋白（ Smad3 ）、转化生长因子 -β1 （ TGF-β1 ）、组蛋白脱乙酰基酶 8 （ α-SMA ）和纤溶酶原激活物抑制剂 1 （ PAI-1 ）表达，从而预防肝纤维化 ^[19] 。山柰酚为柴胡、白芍、甘草的有效化学成分，能够激活活化素受体样激酶（ ALK5 ） ATP 结合口袋的靶向结合，抑制胶原蛋白的合成和肝星状细胞的活化，下调 Smad2/3 磷酸化水平，显著改善肝纤维化 ^[26] 。此外，研究表明，食用富含山柰酚的食物可以降低罹患肝癌的风险，与抑制细胞凋亡、下调上皮 - 间质（ EMT ）相关标记和 P13K-PKB 信号通路等作用机制有关 ^[27] 。山柰酚还可以通过抑制 AKT 、激活某些过氧化物酶体增殖物激活受体，从而发挥降低体内三酰甘油的作用

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